15.5 Ejemplo de clonación con vectores de expresión
Un vector de expresión es una molécula de DNA que, además de incluir las regiones y características propias de un vector de clonación, posee una región promotora de la transcripción, en posición contigua al punto donde se insertará el DNA de interés.
El objetivo es que una vez clonado el inserto éste se transcriba en la célula anfitriona, generando un mRNA, y luego éste se traduzca sintetizándose así la proteína codificada en el inserto.
Puesto que los vectores naturales no poseen habitualmente regiones promotoras o, si lo hacen, pueden no ser adecuadas a los objetivos experimentales, lo común es que el vector de clonación se haya preparado a su vez también mediante la tecnología de DNA recombinante (véase "inserto auxiliar" en pág. 220). En la práctica, no obstante, esta tarea ya está hecha y se adquieren vectores comerciales que incluyen el promotor delante del policonector o sitio de clonado múltiple (pág. 226).
Es muy común el empleo de un promotor inducible (un promotor distal al que se une un factor de transcripción que responda a señales, pág. 286 y 289), para controlar el momento en el que se desea que comience la expresión del gen clonado mediante alguna señal, como la adición de un nutriente o una molécula señalizadora al medio de cultivo de las células anfitrionas.
Ejemplo
Este es un diseño para clonación con expresión en células de mamífero.
El vector de expresión es una molécula de DNA bicatenario circular que puede introducirse
en células anfitrionas de mamífero empleando diversos métodos de transformación
(pág. 229-230). Este vector en particular incluye secuencias propias del
operador lambda
y de un promotor basal simple (por ejemplo, una caja TATA). Cuando se le une una proteína relacionada con el
represor lambda
—que actúa como factor de transcripción con afinidad por la secuencia del operador— se activa la transcripción a partir de ese promotor.
Operador λ
Se trata de una región promotora del DNA bacteriano. Concretamente, la región reconocida por la proteína llamada represor λ.
Represor λ
Esta proteína se une al DNA en la región llamada operador. Posee para ello un motivo hélice-giro-hélice. La union sólo es eficaz si el represor forma un dímero.
El factor de transcripción elegido es una proteína de fusión, una proteína quimérica que combina una parte de la subunidad B de la girasa y el dominio ligante de DNA en el represor λ. Al elegir esta proteína se ha conseguido un control preciso del momento en que se expresará el inserto:
DNA girasa
Es una toposiomerasa bacteriana de tipo II, con estructura tetramérica A2B2.
Las aminocumarinas (como novobiocina, clorobiocina y cumermicina A1) se unen junto al centro activo ATPasa, situado en la subunidad B.
Más información sobre la girasa
- El factor de transcripción tal cual, monomérico, no se une al DNA y no ejerce ningún efecto.
- Si se añade al medio de cultivo
cumermicina, ésta se une al dominio girasa B provocando su dimerización. En el dímero, el dominio del represor λ adquiere afinidad por el DNA y se une en la secuencia del operador. El resultado es que se activa la transcripción del inserto.
Cumermicina
Este compuesto, con estructura de aminocumarina (pág. 274), se emplea como antibiótico porque inhibe la transcripción y la replicación. Ello se debe a que se une a la girasa, una topoisomerasa bacteriana, e inhibe su actividad catalítica.
Sin embargo, su aplicación en este caso no guarda relación con su efecto antibiótico, sino con su capacidad de unirse al dominio procedente de la girasa en la proteína quimérica. Debido a que la estructura de la cumermicina consta de dos mitades idénticas, se une a dos moléculas de girasa y promueve así su dimerización.
(Pulse para cerrar este cuadro) - Si se añade al medio de cultivo
novobiocina (en mayor concentración), ésta se une al dominio girasa B, desplazando a la cumermicina. Como consecuencia, se disocia el dímero del factor de transcripción, desapareciendo el estímulo para la transcripción.
Novobiocina
Se trata de otra aminocumarina, también antibiótico (pág. 274), con estructura similar a la cumermicina pero en este caso no dimérica. Por ello, compite con la cumermicina por la unión a la girasa, pero evitando que ésta dimerice.
(Pulse para cerrar este cuadro)
El uso de cumermicina y novobiocina como moléculas señalizadoras resulta conveniente puesto que poseen baja toxicidad sobre animales y no tienen dianas de acción de alta afinidad en células eucarióticas.
Para conseguir la expresión es, obviamente, necesario aportar a la célula anfitriona el factor de transcripción específico, la proteína quimérica descrita. Esto se consgiue realizando una cotransformación (o cotransfección, pág. 230) de las células con dos DNA recombinantes:
- el vector ya descrito, que incluye el operador λ y el promotor basal, recombinado con el inserto de interés (el que se desea expresar),
- otro vector de expresión, que incluye una región promotora y un gen marcador de selección; el inserto que se recombina con este vector es el DNA que codifica la proteína quimérica (que es una proteína de fusión); este DNA se prepara a su vez conectando
- una parte del gen GyrB (de la girasa), concretamente la región (660 pb) que codifica el dominio N-terminal de la subunidad B de la girasa (sus 220 primeros residuos aminoácidos),
- una parte del gen cI (del represor λ), concretamente la región (393 pb) que codifica el dominio N-terminal, que contiene el motivo ligante de DNA (los 131 primeros aminoácidos).
Las células que incorporen el recombinante nº 2 y lo expresen sintetizarán el factor de transcripción quimérico represor–girasa. Si esas mismas células también han incorporado el recombinante nº 1, el factor de transcripción activará la transcrpción del inserto de interés, que se podrá luego traducir para generar la proteína cuya expresión se pretendía conseguir.