Fundamento de los diferentes tipos de ensayo de viabilidad celular

El concepto de viabilidad alude a la capacidad de una célula para realizar sus procesos fisiológicos y bioquímicos, especialmente en lo relativo a su metabolismo y a su capacidad de división. Sin embargo, en la práctica el término se utiliza con criterios diversos; por ejemplo, es común que se hable de viabilidad refiriéndose simplemente a la integridad de la célula, o bien a su actividad metabólica o, finalmente, a su capacidad de división (proliferación).

Para todos estos criterios se emplean diversos ensayos de viabilidad; algunos de los más frecuentes se describen a continuación. A la hora de comprender el diseño de todos los ensayos de viabilidad hay que prestar atención a dos parámetros fundamentales:

1. La especificidad y la detectabilidad de los reactivos
• Clásicamente se han empleado colorantes, que pueden detectarse:

  	en células individuales, mediante microscopia
  	en suspensiones celulares, mediante absorciometría (habitualmente, ensayos simultáneos de múltiples muestras en placas multipocillo)

• Cada vez con más frecuencia los colorantes se ven reemplazados por fluorocromos, cuya detectabilidad es muy superior, puede combinarse la medida al mismo tiempo de varios fluorocromos distintos y permite, además, el uso de la citometría de flujo.
2. La capacidad de los reactivos para penetrar en las células, es decir, la permeabilidad a través de las membranas celulares.
   • Se trata del factor clave que permite que el ensayo diferencie células intactas de células muertas o dañadas.
   • Básicamente la cuestión se reduce a la polaridad y la carga eléctrica del reactivo o de un producto derivado de él; los compuestos polares (hidrófilos) no atraviesan las membranas, a no ser que éstas se encuentren físicamente dañadas; los compuestos poco polares (lipófilos) sí pueden atravesarlas.

Ensayos de exclusión

Corresponden al recuento de células que no son capaces de incorporar un colorante (lo excluyen).

El ejemplo clásico y más conocido es el azul de tripano, un colorante soluble en agua cuyos grupos cargados amino y sulfonato le impiden atravesar las membranas celulares intactas; por tanto, tiñe sólo las células muertas o dañadas. Las células vivas no se tiñen, pero debe resaltarse que el ensayo sólo valora la integridad su membrana, no la verdadera viabilidad celular.
Ensayo con azul de tripano.

Un ensayo similar utiliza un compuesto fluorescente con carga (por lo que no atraviesa la membrana) que está preparado de modo que reaccione con grupos amino (disponibles en las proteínas y en otras biomoléculas). Las células intactas sólo se tiñen en superficie, débilmente, mientras que las células dañadas se tiñen en todo su interior, de forma intensa. El uso de un fluorocromo –en lugar de un colorante– permite su aplicación en microscopia de fluorescencia y, en particular, en citometría de flujo.

Recuento de células viables por incorporación de un marcador

Se trata de un método alternativo, basado en este caso en la entrada de un compuesto a través de la membrana de las células intactas y su fijación en el interior.

Se trata de un método alternativo, basado en este caso en la entrada de un compuesto a través de la membrana de las células intactas y su fijación en el interior.

En algunos casos, el colorante (en realidad, casi siempre un fluorocromo) se une a los ácidos nucleicos, particularmente al DNA. Esto permite diseñar ensayos muy útiles en los que se tiñen, aunque con distinto color, tanto las células viables como las dañadas. El parámetro clave es siempre la lipofilia de los fluorocromos, que los hace permeantes o no a través de la membrana celular intacta.

Ensayos que miden la actividad metabólica

Actividades enzimáticas

La presencia en las células de actividades enzimáticas genéricas, tales como esterasas y deshidrogenasas, permite plantear ensayos de viabilidad basados en la generación de productos con grupos cromóforos o fluoróforos, procedentes de la transformación enzimática de sustratos sintéticos. Una alternativa, para tipos celulares concretos, es la determinación de una actividad enzimática específica, en cuyo caso es particularmente importante evitar que las condiciones experimentales afecten a dicha enzima.

Síntesis de proteínas

Se mide la incorporación de radiactividad a las proteínas formadas durante el cultivo de las células en presencia de aminoácidos marcados (como [³⁵S]Met o bien cualquier otro marcado con ¹⁴C o ³H).

Síntesis de DNA

Se mide la incorporación de radiactividad, u otro tipo de marca, al DNA formado durante el cultivo de las células en presencia de nucleótidos marcados. Es común el uso de timidina tritiada o de bromodesoxiuridina.

		Explicación detallada
2′-desoxitimidina (coloquialmente, timidina)	5-bromo-2′-desoxiuridina (bromodesoxiuridina, BrdU)

Refleja el concepto más exigente de viabilidad, la capacidad de crecimiento o, más estrictamente, de proliferación celular.