16.6 Estructura y propiedades espectrales de fluorocromos para la secuenciación
(Puede consultar antes los fundamentos de la fluorescencia.)
Las propiedades ideales para un grupo de 4 fluorocromos que permitan secuenciar con el método de terminaión de cadena son:
- Excitación con una longitud de onda común a los 4
- Emisión a longitudes de onda suficientemente separadas para permitir su detección independiente y sin interferencia
- Absortividad similar y elevada (para aumentar la señal)
- Rendimiento cuántico similar y elevado (para aumentar la señal)
- Posibilidad de usar reactivos comunes para los 4
1ª generación
Los primeros fluorocromos que se emplearon fueron:
NBD-Cl (cloro-nitrobenzoxadiazol)
Fluoresceína o carboxifluoresceína (FAM)
TMR (tetrametilrodamina)
TR (rojo Texas)
Sin embargo, requieren el uso de 2 longitudes de onda de excitación (NBD+FAM, TMR+TR), su espectro de emisión se solapa, el brillo de los 4 no es igual, y requerían el empleo de 4 cebadores distintos.
2ª generación
Con este grupo se mejoraron las prestaciones:
FAM 5- o 6-carboxifluoresceína (el nombre FAM procede de su activación como amidita; también se activa como éster de N-hidroxisuccinimida)
JOE (un derivado de fluoresceína)
TAMRA (5- o 6-carboxitetrametilrodamina)
ROX 5- o 6-carboxi-X-rodamina
Poseen mejores propiedades espectrales (las emisiones no solapan, similar rendimiento cuántico), pero aún se requiere el uso de 2 longitudes de onda para la excitación (FAM+JOE, TAMRA+ROX).
Como alternativa surgieron también con una estructura química diferente los fluorocromos BODIPY (FL, R6G, TMR y 581/591; para más detalles véase la ampliación), con espectros similares a los anteriores.
El uso de reactivos comunes para los 4 se resuelve con la posibilidad de marcar los nucleótidos terminadores (didesoxi) en lugar de los cebadores.
3ª generación
Para conseguir la excitación de los 4 flurocromos con una única longitud de onda se acude al fenómeno FRET (transferencia de energía por resonancia): se utilizan dos fluorocromos en cada cebador o terminador, de tal modo que el primero se excite con la radiación empleada y su emisión de fluorescencia sea la que excite al segundo.
Así, por ejemplo, FAM se excita adecuadamente con un láser común de 488 nm, y hace de grupo donador al transferir la energía de su emisión a JOE, TAMRA o ROX, que se excitan más eficazmente de lo que lo harían con la radiación original del láser, y emiten cada uno a su longitud de onda característica.
El fenómeno FRET sólo es eficaz a corta distancia, por lo que sólo tiene lugar entre los fluorocromos ligados al mismo cebador o terminador.
Por ejemplo, en este cebador:
el fluoróforo donador (FAM) está unido al primer nucleótido, mientras que el fluoróforo aceptor (FAM, JOE, TAMRA o ROX) está unido a la base de un nucleótido situado a una distancia de entre 2 y 10 nucleótidos, empleando además un grupo espaciador de 12 átomos para evitar que interfiera con la hibridación.
Otro ejemplo: en este terminador: 
el fluoróforo donador (FAM) está unido al fluoróforo aceptor (ROX) mediante un grupo espaciador de 5 átomos más un anillo bencénico (la posición "R" corresponde al didesoxinucleótido).
Ampliación: estructuras y relación entre diversos fluorocromos.
Ampliación: espectros de fluorescencia.