Cada relleno cromatográfico permite la separación de moléculas en función de un parámetro fisicoquímico, pero eso no siempre permite que se separen entre sí cualquier par de moléculas.
Tomemos como ejemplo la cromatografía de exclusión, o filtración en gel: separa las moléculas dependiendo de su tamaño (que, aunque guarda relación, no es lo mismo que su peso o su masa molecular).
En muchos libros se puede ver que el volumen de elución varía de forma inversamente proporcional a la masa molecular, o a su logaritmo. Esto es correcto pero debe matizarse:
En primer lugar, sólo hay correlación con la masa molecular si las moléculas tienen la misma forma. Esto es debido a que el parámetro que influye realmente es el tamaño, el volumen que ocupa la molécula y, por ello, interviene su forma, no sólo su masa. Si se trata, por ejemplo, de varias proteínas globulares (moléculas compactas, aproximadamente esferoidales), el tamaño se correlaciona con la masa. Si se trata de polisacáridos (moléculas alargadas) también, pero no de forma comparable con proteínas de la misma masa.
Ejemplo: el Sephadex G-75 permite separar proteínas globulares en el intervalo de 3 a 80 kDa, pero separa polisacáridos en el intervalo de 1 a 50 kDa.
En segundo lugar, la correlación sólo se verifica para moléculas cuyo tamaño esté dentro de un cierto intervalo de fraccionamiento, o límites de fraccionamiento, o intervalo de resolución (en español se dice intervalo, no rango*). Las moléculas que son demasiado grandes y no pueden entrar en ninguno de los poros de la matriz no se pueden separar entre sí (no se pueden "resolver"), como tampoco se separan entre sí las que son demasiado pequeñas y penetran sin dificultad en todos los poros. Sólo las moléculas cuyo tamaño les permite penetrar en los poros con cierta dificultad muestran un comportamiento relacionado con su tamaño y se separarán de otras con tamaño algo diferente porque se retardan de manera diferencial, tienen mayor o menor tendencia a penetrar en los poros, que no son todos de un mismo tamaño uniforme.
Veamos como ejemplo la separación de una mezcla de proteínas globulares usando un relleno (F.E.) cuyo intervalo de resolución es de 40 a 200 kDa:
Masa molecular de las proteínas
300 kDa
240 kDa
150 kDa
90 kDa
30 kDa
20 kDa
volumen de elución
A280
La región de comportamiento aproximadamente
lineal
define el intervalo de resolución.
Un razonamiento análogo puede aplicarse a la separación de biomoléculas mediante electroforesis en gel: cada tipo de gel tiene un intervalo de resolución eficaz.
(inglés) range = (español) intervalo (inglés) rank = (español) rango
