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Cromatografía

Definición:

La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes que se han de separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria, F.E.) mientras que la otra (fase móvil, F.M.) se mueve en una dirección definida.

Otras definiciones (en la web): cromatograma, cromatografiar, cromatógrafo, fase ligada, fase inmovilizada, eluir, efluente, muestra, componentes de la muestra, soluto, disolvente, zona.

Otros términos: columna, lecho cromatográfico, empaquetamiento... (véase la sección de nomenclatura).

Hay 3 métodos principales de cromatografía: frontal, de desplazamiento y de elución. Sólo consideraremos este último, que es el más habitual, al menos en Bioquímica y Biología Molecular.

Clasificación de las técnicas cromatográficas

1. De acuerdo con la forma del lecho cromatográfico:

1.1 Cromatografía plana

Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse “en capa fina” o “en capa delgada” porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y rígido.

Cromatografía ascendente en capa fina Disposiciones experimentales para realizar una cromatografía en papel descendente (izqda.) y ascendente (dcha.).

Cromatografía ascendente en capa fina: colocación de una muestra (con 3 componentes), desarrollo de la cromatografía y revelado del cromatograma.

 

Rf es el factor de retardo o retraso, que mide la movilidad relativa de cada componente con respecto al máximo posible, la distancia recorrida por el frente de fase móvil.

Componente 1: Rf = a / D
Componente 2: Rf = b / D
Componente 3: Rf = c / D


1: aplicación de la muestra
2: se sumerge el extremo inferior en la fase móvil
3 a 5: la fase móvil asciende por capilaridad y se va produciendo la separación de los componentes
6: se marca el frente de avance del disolvente y se deja secar la placa
7: revelado de los componentes ya separados y medida de su avance

1.2 Cromatografía en columna

F.M. líquida, F.E. sólida: columnas de varios mm de diámetro y varios cm de longitud.
F.M. gas, F.E. sólida: columnas de unos 5 mm de diámetro y 1-20 m de longitud.
F.M. gas, F.E. líquida: columnas “capilares”, con menor diámetro y 30-100 m (incluso más) de longitud.

Puede verse una animación del avance de las moléculas por la columna.

Funcionamiento de una columna, mostrando la carga de la muestra y diversos momentos a lo largo de la elución:

  1. Muestra depositada sobre el lecho cromatográfico
  2. La muestra penetra en el lecho
  3. Se añade fase móvil
  4. Comienza la separación de los componentes de la muestra
  5. Eluye el primer componente
  6. Eluye el segundo componente

2. De acuerdo con el estado físico de las fases

    fase móvil
    líquida gaseosa
    “cromatografía
líquida”
“cromatografía
de gases”
fase
estacionaria
sólida Cromatografía
líquido-sólido
Cromatografía
gas-sólido
líquida Cromatografía
líquido-líquido
Cromatografía
gas-líquido

2.1 Cromatografía de gases

Con fase móvil gaseosa.

2.2 Cromatografía líquida

Con fase móvil líquida.

2.2.1 HPLC

Cromatografía líquida de alta presión o de alta eficacia (cuando se emplean particulas de fase estacionaria muy pequeñas y una presión de entrada relativamente alta).
[HPLC, de High Pressure Liquid Chromatography / High Performance Liquid Chromatography]

3. De acuerdo con el mecanismo de separación

Nota: Ésta es una clasificación conceptual; en la práctica, el mecanismo que rige la separación puede ser mixto; p.ej., adsorción+reparto.

3.1 Cromatografía de adsorción

(atención: es adsorción, no absorción)

Diferente afinidad de adsorción de los componentes de la muestra sobre la superficie de un sólido activo. La adsorción es la capacidad de las superficies para fijar moléculas.

La F.E. es siempre sólida. Ejemplos: alúmina, gel de sílice, carbón activo, fosfato cálcico, hidroxiapatito...

3.2 Cromatografía de reparto

Diferente solubilidad de los componentes de la muestra en la fase estacionaria (caso de la cromatografía de gases), o diferentes solubilidades de los componentes en las fases móvil y estacionaria (caso de la cromatografía líquida).

Ejemplos: en cromatografía plana, la F.E. es el agua o disolvente asociados a la celulosa (papel) o al soporte sólido que forma la capa fina; en columna, como F.E. se usan tierra de diatomeas, gel de sílice, celulosa en polvo...

3.3 Cromatografía de intercambio iónico

Diferente afinidad de los componentes de la muestra para el intercambio de iones. ¿Qué significa intercambio de iones? La F.E. posee carga eléctrica y por ello interacciona con los componentes de la muestra que tienen carga opuesta.

Ejemplos de grupos funcionales intercambiadores (unidos covalentemente a la F.E. sólida):

intercambiadores catiónicos intercambiadores aniónicos
carboxilato
sulfonato
fosforilo
carboximetilo (CM)
sulfopropilo (SP)
dietilaminoetilo (DEAE)
dietil-(2-hidroxipropil)aminoetilo
polietilenimina

La F.E. suele llamarse “resina” (de intercambio iónico).

Puede verse una animación de una cromatografía de intercambio aniónico.

Las biomoléculas poseen frecuentemente varios grupos ionizables, de modo que su carga eléctrica neta depende del pH del medio en el que se encuentran (es decir, la F.M.).

3.4 Cromatografía de exclusión

También se llama de exclusión molecular. Estrictamente, se basa en diferencias de tamaño, forma o carga entre las moléculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo más habitual es aprovechar las diferencias de forma y tamaño. En este caso, se la llama también cromatografía de exclusión por tamaño, de filtración en gel, de permeación en gel o de tamiz molecular.

Esquema de la separación de moléculas de distinto tamaño durante una cromatografía de exclusión.

 

Pulsando sobre la imagen de la columna a la derecha se mostrará el aspecto en detalle del relleno, que ilustra el diferente acceso de las moléculas a los poros dependiendo del tamaño de aquéllas.

entrada de fase móvil
detector
columna
cromatográfica
con
relleno poroso
señal

Pueden verse dos animaciones (A y B) de una cromatografía de exclusión.

Ejemplos: para la separación de proteínas y polisacáridos se usan como F.E. polímeros lineales entrecruzados (es decir, que forman enlaces transversales). Los más comunes son dextranos (marca comercial: Sephadex), agarosa (Sepharosa y Biogel A) y poliacrilamida (Biogel P). Estos materiales, en forma de pequeñas esferas, se expanden o hinchan al sumergirlos en disoluciones acuosas, generando un retículo o matriz tridimensional, con poros de tamaño definido.

Aplicaciones:

3.5 Cromatografía de afinidad

Variedad particular de cromatografía en la que la separación se basa en la especificidad biológica singular de interacción entre un componente de la muestra y otra molécula unida a la F.E.; los ejemplos más comunes son las interacciones enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo y ligando-receptor.

F.E.: un soporte inerte (microesferas de vidrio o plástico, gel de agarosa, ...) al que se une covalentemente el ligando de afinidad. Ejemplos de este ligando: sustrato, inhibidor o cofactor de una enzima, anticuerpo, antígeno, hapteno, sustancia transportada, hormona, oligosacáridos, lectinas (proteínas con afinidad por oligosacáridos)...

Pueden verse dos animaciones (A y B) de una cromatografía de afinidad.

4. Algunas técnicas especiales

4.1 Cromatografías de fase normal y de fase invertida

Fase normal: cuando la F.E. es más polar que la F.M.

Fase invertida: cuando es más polar la F.M.

[Nota: se suele ver el término "fase reversa", expresión incorrecta que debe evitarse (la normativa IUPAC indica que en inglés debe decirse Reversed Phase y no Reverse Phase).]

4.2 Análisis isocrático

La composición de la fase móvil permanece constante a lo largo del proceso de elución.

4.3 Elución con gradiente

La composición de la fase móvil se cambia, de forma continua o en etapas, a lo largo del proceso de elución (respectivamente, gradiente continuo y gradiente escalonado o en etapas).

4.4 Cromatografía bidimensional

Una vez separados los componentes de la muestra, parte de ellos o todos se someten a etapas adicionales de separación bajo diferentes condiciones, en otra columna o, en el caso de la cromatografía plana, en dirección perpendicular.

Ejemplo: Huellas dactilares estudio de proteínas (Freifelder-193ss)

Etapas en la realización de una cromatografía

Cromatografía en columna Cromatografía plana (papel o capa fina)
1.- Preparación del soporte y fase estacionaria. 1.- Preparación del soporte y fase estacionaria.
1.1.- Equilibrado de la columna.  
2.- Aplicación de la muestra.

2.- Aplicación de la muestra.
Secado.

3.- Elución:
a) Lavado de componentes no retenidos.
b) Liberación, desplazamiento o elución propiamente dicha de los componentes retenidos.

3.- Desarrollo de la cromatografía.

4.- Recolección de fracciones o análisis del efluente en continuo. 4.- Secado de la placa.
5.- Análisis, cuantificación o revelado. 5.- Revelado y cuantificación en su caso.
6.- Regeneración de la fase estacionaria.  

Recogida del efluente

El efluente de una columna se suele recoger en forma de pequeñas porciones o fracciones, comúnmente con la ayuda de un dispositivo mecánico llamado colector de fracciones.

 

Esquema de un colector de fracciones. En cada tubo cae un número determinado de gotas o un cierto volumen. A continuación el soporte gira, de modo que el tubo siguiente queda colocado bajo la salida del efluente. Las gotas se detectan mediante una célula fotoeléctrica; cada gota interrumpe el haz de luz y así se cuenta.

Detección

Los componentes de la muestra separados se detectan en el efluente:

  1. Mediante su análisis en continuo. Por ejemplo:
  2. O bien mediante el análisis de las fracciones una vez recogidas.