Cromatografía de afinidad

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a) El principio de la separación es la interacción específica entre moléculas de uno de los componentes de la muestra y moléculas unidas al soporte, fase estacionaria, gel o resina "de afinidad" que rellena la columna. Esta especificidad o afinidad procede de una complementariedad a escala molecular, en la que participan fuerzas de enlace débiles de los tipos van der Waals, enlaces de hidrógeno, hidrofobicidad o interacciones iónicas. Ejemplos clásicos son las interacciones enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo o ligando-receptor. En el ejemplo mostrado en la película esto se simboliza con la forma circular o no de las moléculas y de los "huecos" existentes en la resina.

b) Las moléculas que han quedado retenidas en la columna debido a su afinidad por la fase estacionaria se liberan mediante un cambio del medio eluyente a condiciones en las que la interacción se debilite: generalmente se cambian el pH (lo que afecta al estado de ionización de las biomoléculas), la fuerza iónica (concentración de sales, que afecta a las interacciones iónicas) o la polaridad del eluyente.

c) Al igual que en otros tipos de cromatografía, las moléculas que interaccionan más favorablemente con la fase estacionaria (relleno de la columna) avanzan más despacio y salen por la parte inferior más tarde (eluyen más despacio). A diferencia del ejemplo de cromatografía de exclusión, aquí no se recogen fracciones del eluido, sino que se detecta en éste de forma continua la concentración de componentes de la muestra (por ejemplo, una medida de absorbancia en el ultravioleta permite detectar proteínas y ácidos nucleicos); en ambos casos sirven ambos planteamientos de detección.