10.11 Ejemplo de extracción directa del DNA

Etapa 1: retención de los ácidos nucleicos (adsorción)

Se prepara la muestra (lisado celular) empleando un medio especialmente formulado (tampón "A"), que contiene detergentes y caótropos así como, posiblemente, proteasas.

Los detergentes lisan las células, al solubilizar sus lípidos de membrana, y también colaboran en la desnaturalización y solubilización de las proteínas (que, en el caso de haber utilizado proteasas, estarán parcialmente fragmentadas).

Los caótropos desnaturalizan las proteínas y las mantienen solubles. Las proteínas componentes de la cromatina y de los ribosomas quedan así separadas de los ácidos nucleicos respectivos (DNA y RNA).

Para la separación se emplean materiales membranosos o matrices de relleno. Por ejemplo, un derivado de gel de sílice u otro material de naturaleza polar, empaquetado en una minicolumna adaptable a un tubo. La clave está en que el relleno posea mayor polaridad que el tampón "A", lo que permite que las proteínas desnaturalizadas, los lípidos y otros componentes celulares se mantengan disueltos, mientras que los ácidos nucleicos, más polares (polianiónicos) interaccionan más favorablemente con el relleno que con el tampón A.

Una vez retenidos DNA y RNA en la columna, se realizan unos lavados empleando el mismo tampón A, para arrastrar cualquier resto que quede en los poros del relleno.

aplicar la muestra a la columna

centrifugar (o bien pasar el líquido bajo presión)

resultado

continuar

Etapa 2: elución de los ácidos nucleicos

aplicar la muestra a la columna

centrifugar (o bien pasar el líquido bajo presión)

resultado

A continuación, se aplica un nuevo tampón "B", cuya característica esencial es poseer mayor polaridad. Como consecuencia, los ácidos nucleicos pierden afinidad por el relleno y quedan disueltos en este tampón B, eluyendo de la columna.

En la discusión anterior no se establecen diferencias entre DNA y RNA, pues sus propiedades fisicoquímicas son similares. Si la intención es purificar DNA, debe añadirse una RNasa, bien en el tratamiento inicial (tampón A) o bien al terminar la extracción. Si se pretende extraer el RNA, se puede análogamente utilizar una DNasa.