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Diseño de un experimento para obtener los parámetros cinéticos de la fosfatasa alcalina

Reacción de la fosfatasa alcalina

Esta enzima cataliza la hidrólisis de algunos ésteres fosfóricos. La actividad óptima de la enzima se consigue a pH alcalino.

pNFP
pNF
+     Pi

Uno de los compuestos usados en el laboratorio como sustrato de esta enzima es el para-nitrofenilfosfato (pNFP), que la enzima hidroliza dando fosfato inorgánico (Pi) y para-nitrofenol. A pH alcalino este pNF tiene color amarillo, cuya intensidad podemos medir en un espectrofotómetro.

Prepararemos mezclas del sustrato (pNFP), el extracto que contiene la enzima y un tampón de pH alcalino, y mediremos la actividad de la enzima como velocidad de formación del producto, pNF amarillo. La velocidad de la reacción se expresa como aumento de concentración del pNF por unidad de tiempo.

Exploración del efecto de la concentración de sustrato (curva de Michaelis y Menten)

1. Diseño del experimento

Escribe en las casillas las cantidades (volumen en µℓ) de cada reactivo que deseas poner en cada tubo:

  tubo 1tubo 2tubo 3tubo 4tubo 5tubo 6
disolución 100 mM del sustrato, pNFP       
extracto enzimático       
disolución tampón 2x       
agua       

El tampón de pH=10.5 está formado por carbonato y bicarbonato en concentración 20 mM, que es el doble de la necesaria en la mezcla de ensayo final.

si es correcta la preparación de los tubos de ensayo.

Una vez que el diseño sea correcto, calcula la concentración del sustrato (pNFP) en cada tubo:

  tubo 1 tubo 2 tubo 3 tubo 4 tubo 5 tubo 6
[pNFP] (mM)

si es correcto tu cálculo de las concentraciones
y después pasa a la siguiente etapa:

2. Realización del ensayo enzimático

La reacción se inicia al añadir el extracto enzimático y mezclar todos los componentes, y se detiene tras 10 minutos para medir el producto formado. Aquí debajo se muestran los resultados.

(cada tubo se ensaya
por duplicado)

Medidas de absorbancia obtenidas:
  A405   A405   A405   A405   A405   A405
1   2   3   4   5   6  
1′   2′   3′   4′   5′   6′  

Anota las medidas de absorbancia antes de pasar a la siguiente etapa:

3. Cálculo de las concentraciones de producto formado

Visita esta página donde debes preparar (en la pestaña “Actividad 1”) varios tubos con mezclas de concentración conocida de pNF y medir su absorbancia; con esos datos, construye una recta de calibrado de pNF.

Calcula a continuación (y comprueba tus cálculos en aquella misma página) las concentraciones de pNF que corresponden a las absorbancias obtenidas en la etapa 2 aquí arriba.

4. Cálculo de las velocidades de reacción

A partir de las concentraciones de pNF, calcula la velocidad de formación del producto (velocidad de la reacción o actividad enzimática) para cada tubo de ensayo.

5. Representación gráfica y obtención de los parámetros por regresión

Construye una gráfica representando velocidad (etapa 4) frente a concentración de sustrato (etapa 1).

En el panel que se muestra aquí a la derecha, introduce los datos de [pNFP] y ѵ, sigue las instrucciones paa hacer la regresión y obtén así los valores de los parámetros cinéticos, Km y ѵmáx para la fosfatasa alcalina.

 

 

Resultado de las medidas de actividad enzimática:
[S] , ѵ

Puedes seleccionar todo el texto y copiarlo para llevarlo a la página de regresión no lineal y obtener allí los valores estimados de Km y ѵmáx

"n/d" significa no disponible, fuera de escala, no se puede determinar