Para iniciar los experimentos, pulsa en una de las pestañas de la línea superior y luego en una de las pestañas que aparecerán en la segunda línea.
Qué son las pipetas Pasteur y cómo se usan (vídeo)
Uso de un espectrofotómetro y de las cubetas (con vídeos)
Al pulsar en una de las botellas de reactivo se abrirá su tapón; a partir de ese momento la pipeta tomará de ese reactivo. Al pulsar de nuevo sobre la botella o su tapón, se cerrará.
Truco: mientras una botella esté abierta, basta con pasar el puntero por encima de la pipeta para que ésta se llene de nuevo.
Para añadir una alícuota de muestra a una cubeta:
- Selecciona una cubeta pulsando en ella o en la opción bajo ella.
- Pulsa en la pipeta.
Truco: se puede vaciar la pipeta (si se tomó líquido por error) pulsando con el botón derecho sobre ella.
Para vaciar una cubeta, selecciónala y luego pulsa en el recipiente de
desechos.
Para conectar y desconectar el espectrofotómetro, pulsa el interruptor
Para acceder al compartimento de la cubeta, pulsa el cierre
o la propia tapa.
Para introducir una cubeta en el espectrofotómetro y para sacarla:
- Selecciona una cubeta pulsando en ella o en la opción bajo ella.
- Pulsa en una de las flechas
- (Atención, es necesario que la tapa del compartimento esté abierta)
Acción de los botones e iconos:
registra la medida en la pantalla externa
registra un espectro
borra toda la información mostrada en la pantalla
captura una imagen del espectro, que podrá copiarse o guardarse (*),
o captura la lista de medidas de absorbancia de la pantalla en un formato más adecuado paa copiarlas
-
simboliza el recipiente de desechos; al pulsar sobre él, se vaciará la cubeta seleccionada
La pipeta dispensa alícuotas de 1 mL. Cada cubeta tiene una capacidad de 3 mL; si la superas, se derramará (después se vaciará la cubeta para poder continuar). Para poder medir en el espectrofotómetro, la cubeta debe contener al menos 2 mL de muestra.
La lectura de absorbancia indica ##### cuando no es posible medir: si la tapa del compartimento está abierta o si el volumen en la cubeta es insuficiente.
*) Ayuda para guardar o pegar la "foto" del resultado:
- Normalmente el navegador de internet ofrece en su menú contextual una opción “guardar imagen” que la grabará en un arhivo de formato PNG (pulsando sobre la imagen con el botón derecho del ratón).
- En el mismo menú suele haber otra opción “copiar imagen”. Luego se puede pegar en otro programa, pero es posible que no funcione con el método “pegar” normal; prueba a hacer “pegado especial” y elegir “mapa de bits” o “imagen PNG”
- Todo esto no funciona sobre la gráfica que se muestra en la pantalla dibujada bajo el espectrofotómetro,
sólo funciona sobre la "foto" que se abre en el centro de la ventana al pulsar el icono
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Pigmentos vegetales, experimento 1: espectros de absorción de pigmentos (patrones)
Objetivo: registrar y comparar el espectro de absorción de luz visible de diversos pigmentos vegetales: clorofila a, clorofila b y β-caroteno.
Materiales: Utilizaremos disoluciones de tres pigmentos puros (estándares de clorofila a, clorofila b y β-caroteno) disueltos en un disolvente adecuado.
Procedimiento:
- Calibra el espectrofotómetro con el disolvente: para hacerlo, llena una cubeta con 3 mL del disolvente, introdúcela en el espectrofotómetro, pulsa el botón “A=0” para poner el equipo en cero de absorbancia y evitar la interferencia del disolvente en el espectro de absorción de los pigmentos. Saca la cubeta y descarta el contenido.
- Realiza el barrido espectral de cada pigmento: Para ello, llena cada una de las cubetas con 3 mL de cada pigmento. Introduce cada cubeta, de una en una, en el espectrofotómetro, pulsa el botón
para registrar el barrido espectral y obtener el espectro de absorción. Guarda la imagen obtenida pulsando en , para poder comparar los espectros al terminar el experimento y para incluir las imágenes en el informe de laboratorio con su epígrafe correspondiente.
- Para analizar directamente cada espectro puedes moverte con las flechas que están al lado del visor de la longitud de onda λ (▲▼) y visualizar el valor de absorbancia para cada λ.
Análisis de resultados (debes incluir las preguntas y respuestas en el informe de laboratorio)
- Pega la imagen de cada espectro de absorción indicando a qué pigmento pertenece.
- Analiza el espectro para cada pigmento y anota dos longitudes de onda en las que haya un pico (máximo local) de absorción. Además, anota la absorbancia de cada pico (puedes utilizar la tabla siguiente).
- Observa y compara la estructura de las moléculas de clorofila a y clorofila b que se presentan en la sección "fundamento" (más abajo en esta página).
a. ¿Observas estructuras muy diferentes? Explica cuál es la diferencia entre ambas.
b. Explica si esa diferencia se ve reflejada en los espectros de absorción. - Observa la estructura de la molécula de β-caroteno y compárala con las moléculas de clorofilas.
a. ¿Observas estructuras muy diferentes? Explica cuál es la diferencia entre ellas.
b. Explica si esa diferencia se ve reflejada en los espectros de absorción de cada uno de estos 3 compuestos. - Explica si la obtención del espectro de absorción de una sustancia podrá servir para identificar o caracterizar compuestos diferentes.
Fundamento
La energía radiante proveniente del sol se almacena en los organismos fotosintéticos donde pigmentos tales como la clorofila y otros pigmentos asociados actúan como moléculas captoras de la energía radiante ultravioleta y visible1.
La clorofila constituye el pigmento verde de las plantas y juega un rol vital en la fotosíntesis, proceso por el cual las plantas convierten agua, dióxido de carbono y luz solar (una de las formas de energía) en carbohidratos. En las plantas predomina la clorofila a, aunque también puede haber presencia de clorofila b. Ambos pigmentos presentan leves diferencias en la estructura1,2, tal como puede observarse en las estructuras de la Figura 1.
Los carotenoides son otro grupo importante de pigmentos fotosintéticos, se pueden clasificar en carotenos y xantofilas. Los carotenos son generalmente los responsables de los colores amarillos o naranjas de flores, frutas y raíces. El caroteno más común es el β-caroteno1,2.
En un espectro de absorción se puede relacionar la intensidad de la absorción originada por el pigmento con la longitud de onda de cada radiación que se ha hecho incidir sobre la disolución. En dicho espectro es usual observar máximos de absorción (picos) a una determinada longitud de onda, que son característicos de cada compuesto. La variable que mide la intensidad de la absorción se denomina absorbancia (A)1.
| clorofila a | clorofila b | β-caroteno |
 |
 |
 |
Referencias:
- Díaz de Vivar, E.; Solís, M. y Avaro, M. 2018. Química orgánica: de la arquitectura molecular a la función biológica. Comodoro Rivadavia: EDUPA. ISBN: 978-987-1937-92-9. Disponible en línea.
- Mancilla, E.; Castrejón, R., Rosas, M.; Blanco, Z. y Pérez J. 2013. Extracción y separación de pigmentos vegetales. México. Universidad del Valle de México.
Pigmentos vegetales, experimento 2: Espectro de absorción de pigmentos separados por cromatografía en columna
Objetivo general: identificar o caracterizar, a través de su espectro de absorción, los pigmentos que se encuentran en un extracto vegetal y en sus 2 fracciones separadas por cromatografía.
Anota en tu cuaderno de laboratorio el código asignado a tu experimento (en este caso es
???).
Objetivos específicos:
- Analizar los espectros de absorción de las distintas fracciones obtenidas a partir de extractos vegetales luego de realizar una cromatografía de adsorción en columna.
- Comparar los espectros de absorción de las fracciones de pigmentos vegetales entre sí.
- Identificar los compuestos presentes en cada una de las fracciones cromatográficas, por comparación de sus espectros de absorción con los espectros de los siguientes patrones: β-caroteno y clorofila a.
- Comparar los espectros de absorción de las fracciones cromatográficas con el extracto previo a la cromatografía.
Materiales: Utilizaremos disoluciones de dos pigmentos puros (estándares) (clorofila a y β-caroteno) y dos fracciones con pigmentos vegetales obtenidas luego de separarlos por cromatografía en columna a partir de un extracto de espinaca, acelga o microalgas.
Diseño del experimento:
- Calibra el espectrofotómetro con el disolvente: para ello, llena una cubeta con 3 mL del disolvente orgánico como blanco de reactivos, introdúcela en el espectrofotómetro y pulsa el botón “A=0” para poner el equipo en cero de absorbancia. Retira la cubeta y descarta su contenido.
- Realiza el barrido espectral: para eso, coloca en las cubetas 3 mL de cada una de las muestras. Introduce cada cubeta, de una en una, en el
espectrofotómetro y pulsa el botón
para registrar el barrido espectral y obtener el espectro de absorción. Guarda las imágenes obtenidas pulsando en , para comparar los espectros al terminar el experimento e incluirlas en el informe, con su epígrafe correspondiente.
- Para analizar directamente cada espectro puedes moverte con las flechas que están al lado del visor de la longitud de onda λ (▲▼) y visualizar el valor de absorbancia para cada λ.
Análisis de resultados:
- Analiza los espectros de absorción obtenidos para cada muestra que figura en la siguiente tabla (que deberás registrar en tu cuaderno
y en el informe de laboratorio), indicando la longitud de onda de los máximos locales (λ) en el intervalo entre 350 y 750 nm.
Tabla 2. Registro de datos para realizar un análisis de los espectros de absorción de pigmentos de estándares y de extractos de muestras vegetales. nº de cubeta Longitud de onda de los
máximos locales (λ, nm)Estándar de β-caroteno Estándar de clorofila a Extracto vegetal 1ª fracción cromatográfica 2ª fracción cromatográfica - Teniendo en cuenta los espectros de absorción de los estándares (clorofila a y β-caroteno):
a. ¿Qué puedes decir acerca del espectro de absorción de la 1ª fracción cromatográfica?
b. ¿Qué puedes decir acerca del espectro de absorción de la 2ª fracción cromatográfica?
c. ¿Qué puedes decir acerca del espectro de absorción del extracto vegetal?
d. Si la 1ª fracción se eluyó de la columna cromatográfica con el disolvente hexano y la segunda con acetona, ¿qué puedes decir de la polaridad de los diferentes pigmentos? Sugerencia: analiza la estructura de los estándares en la figura 1 de la pestaña "1" de pigmentos.
Pigmentos vegetales, experimento 3: Relación entre absorbancia y concentración
Objetivo: Analizar el efecto de la concentración de un pigmento vegetal sobre su espectro de absorción mediante el análisis del espectro de absorción.
Calibración: para ello, llena una cubeta con 3 mL del disolvente como blanco de reactivo, introdúcela en el espectrofotómetro y pulsa el botón “A=0” para poner el equipo en cero de absorbancia. Saca la cubeta y vacíala.
Diseño del experimento:
- Utilizando uno de los pigmentos y el disolvente, prepara 3 muestras en sendas cubetas, que contengan distintos volúmenes del pigmento, siempre con un volumen final de 3 mL.
Puedes organizarte rellenando la siguiente tabla con los volúmenes a colocar en cada cubeta:
Tabla 3A. Registro de la preparación de muestras para analizar la relación entre absorbancia y concentración del pigmento Pigmento seleccionado: Nº de cubeta: Volumen del pigmento (mL): Volumen de disolvente (mL): - Una vez preparadas las 3 cubetas, toma una foto para incluirla en el informe y, además, vuelca tanto en tu cuaderno como en el informe de laboratorio los valores que has completado en la tabla precedente.
- Realiza el barrido espectral a las diferentes disoluciones: para eso, introduce cada cubeta, de una en una, en el espectrofotómetro y pulsa el botón
para registrar el espectro de absorción de cada dilución. Guarda la imagen obtenida pulsando en para comparar los espectros al terminar el experimento e incluirlas en el informe.
Análisis de resultados (incluye estas preguntas y sus correspondientes respuestas en el informe de laboratorio)
- Analiza los espectros de absorción obtenidos para cada disolución y compáralos entre sí:
Mide y anota la intensidad de la absorbancia y la longitud de onda de los dos picos de mayor intensidad de absorción para cada una de las muestras, según la siguiente tabla.Tabla 3B. Análisis de los espectros de absorción Primer pico Segundo pico nº de cubeta Longitud de onda (λ1, nm) Absorbancia Longitud de onda (λ2, nm) Absorbancia - ¿Qué efecto se observa al diluir la disolución del pigmento seleccionado?
- ¿Cambia la posición de la λ de los picos de absorción máxima? Explica la respuesta.
Pigmentos vegetales, experimento 4: Cuantificación de la concentración de pigmento en una muestra incógnita.
Objetivo: preparar una curva de calibrado con uno de los pigmentos para poder medir la concentración desconocida en una muestra de interés.
Materiales: Utilizaremos una disolución de clorofila a. Luego puedes repetir el ensayo con otros pigmentos, pero eligiendo la longitud de onda correcta para su cuantificación: λ= 663 nm para la clorofila a y λ= 480 nm para el β-caroteno.
Calibración: Primeramente, llena una cubeta con 3 mL del disolvente (acetona al 90% en agua), introdúcela en el espectrofotómetro, ajusta la longitud de onda adecuada y pulsa el botón “A=0”. Saca la cubeta y vacíala.
Si cambias de longitud de onda para medir otro pigmento, debes realizar de nuevo la calibración.
Para realizar las diluciones necesarias con precisión, en este experimento en lugar de una pipeta Pasteur utilizamos una pipeta de bulbo con doble enrase:
~~ 1ª parte: clorofila a ~~
Diseño del experimento: Utilizando la clorofila a y el disolvente, prepara 3 muestras en sendas cubetas, que contengan distintos volúmenes de clorofila a y siempre un volumen total de 3 mL.
Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que hagas en tu cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en cada cubeta:
| cubeta: | 1 | 2 | 3 | |
| volumen de clorofila a: | mL | |||
| volumen de disolvente: | mL |
Una vez preparadas las 3 mezclas en las 3 cubetas, introdúcelas de una en una al espectrofotómetro y anota sus medidas de absorbancia. También puedes pulsar el botón
para registrar cada dato de absorbancia en la pantalla bajo el espectrofotómetro.
| cubeta: | 1 | 2 | 3 |
| A663 = |
Análisis cualitativo de resultados: Observa la relación entre el color de las cubetas y el valor de absorbancia. Comparando las 3 medidas, ¿observas alguna dependencia entre el valor de absorbancia y la mayor o menor concentración de clorofila a en la cubeta?
Análisis cuantitativo de resultados: Calcula la concentración de clorofila a en la mezcla final de cada cubeta, sabiendo que la concentración en la botella es de 1 mg/L. Prepara una tabla con los datos y traza una gráfica representando A (absorbancia) frente a C (concentración). ¿Cómo puedes describir lo que observas?
| cubeta | C (mg/L) |
A663 | A663
Cclorofila a (mg/L)
|
| 1 | |||
| 2 | |||
| 3 |
A partir de la gráfica, resuelve este ejercicio:
Se mezclan 2 mL de una muestra problema con 1 mL de disolvente. Calcula la concentración de clorofila a en la muestra de partida si el ensayo ha proporcionado
un valor A663 = descubrir el valor
Escribe tu resultado: C =
mg/L y verifica si es correcto.
~~ 2ª parte: β-caroteno ~~
Repite todo el proceso con β-caroteno, midiendo en este caso la absorbancia a 480 nm (la concentración de caroteno en la botella es de 1 mg/L).
(Calibración + diseño del experimento + análisis de resultados)
A partir de la gráfica, resuelve este ejercicio:
Se mezcla 1 mL de una muestra problema con 2 mL de disolvente. Calcula la concentración de β-caroteno en la muestra de partida si el ensayo ha proporcionado
un valor A480 = descubrir el valor
Escribe tu resultado: C =
mg/L y verifica si es correcto.
~~ 3ª parte: muestra incógnita ~~
Anota en tu cuaderno de laboratorio el código asignado a tu experimento (que en este caso es ???).
Vamos a analizar tanto el extracto vegetal como sus dos fracciones obtenidas mediante cromatografía (consulta la pestaña Pigmentos 2:extractos para más información)
Ten en cuenta que, si la absorbancia obtenida en cualquiera de los ensayos fuera superior a la máxima que se obtuvo en la recta de calibrado para la misma longitud de onda, no debes utilizar ese dato. Será necesario preparar en una cubeta vacía una muestra más diluida que lo indicado, de modo que su absorbancia entre dentro de la recta de calibrado. Obviamente, dicha dilución deberá tenerse en cuenta para el cálculo posterior de la concentración.
a) Extracto vegetal
Mezcla en la cubeta 2 mL del extracto vegetal con 1 mL de disolvente. Mide su absorbancia a 480 y a 663 nm (antes de la medida a cada longitud de onda debes calibrar A=0 en esa misma longitud de onda, usando otra cubeta que sólo tenga disolvente).
Calcula las concentraciones de clorofila a y de β-caroteno en el extracto:
mg/L de clorofila a, y
mg/L de β-caroteno
Verifica si es correcto.
b) Fracción 1
Mezcla en la cubeta 2 mL de la fraccción 1 con 1 mL de disolvente. Mide su absorbancia a 480 y a 663 nm (antes de la medida a cada longitud de onda debes calibrar A=0 en esa misma longitud de onda, usando otra cubeta que sólo tenga disolvente).
Calcula las concentraciones de clorofila a y de β-caroteno en la fracción 1:
mg/L de clorofila a, y
mg/L de β-caroteno
Verifica si es correcto.
c) Fracción 2
Mezcla en la cubeta 2 mL de la fracción 2 con 1 mL de disolvente. Mide su absorbancia a 480 y a 663 nm (antes de la medida a cada longitud de onda debes calibrar A=0 en esa misma longitud de onda, usando otra cubeta que sólo tenga disolvente).
Calcula las concentraciones de clorofila a y de β-caroteno en la fracción 2:
mg/L de clorofila a, y
mg/L de β-caroteno
Verifica si es correcto.
Also available in English