Espectrofotómetro UV-VIS virtual

Selecciona la micropipeta que quieres usar pulsando en la opción sobre ella.

Qué son las micropipetas y cómo se usan (vídeo) en ventana nueva

Uso de un espectrofotómetro y de las cubetas (con vídeos) en ventana nueva

Al pulsar en una de las botellas de reactivo se abrirá su tapón y la pipeta que esté seleccionada tomará de ese reactivo.

Para añadir una alícuota de muestra a una cubeta:

  1. Pulsa en una de las botellas para que la pipeta se cargue en ella.
  2. Selecciona una cubeta pulsando en ella o en la opción bajo ella.
  3. Pulsa en la pipeta y verterá su contenido en la cubeta.

Para vaciar una cubeta, selecciónala y luego pulsa en el recipiente de desechos.

Para conectar y desconectar el espectrofotómetro, pulsa el interruptor

Para acceder al compartimento de la cubeta, pulsa el cierre o la propia tapa.

Para introducir una cubeta en el espectrofotómetro y para sacarla:

  1. Selecciona una cubeta pulsando en ella o en la opción bajo ella.
  2. Pulsa en una de las flechas
  3. (Atención, es necesario que la tapa del compartimento esté abierta)

Acción de los botones e iconos:

  • registra la medida en la pantalla externa
  • limpia borra toda la información mostrada en la pantalla
  • foto captura los datos mostrados en la pantalla, de modo que se puedan copiar para transferirlos a una hoja de cálculo o un documento
  • simboliza el recipiente de desechos líquidos; al pulsar sobre él, se vaciará la cubeta seleccionada
  • simboliza el recipiente de desechos sólidos; al pulsar sobre él se desecha la punta de pipeta (tenga o no líquido)
  • es un cronómetro auxiliar, que se pone en marcha desde cero al pulsar sobre su parte izquierda; no es imprescindible para hacer el experimento

Las pipetas dispensan alícuotas de 1000 o 200 µL, respectivamente. Cada cubeta tiene una capacidad de 3 mL; si la superas, se derramará (después se vaciará la cubeta para poder continuar). Para poder medir en el espectrofotómetro, la cubeta debe contener al menos 2 mL de muestra.

La lectura de absorbancia indica ##### cuando no es posible medir: si la tapa del compartimento está abierta o si el volumen en la cubeta es insuficiente.

Determinación de la actividad gamma-glutamiltranspeptidasa en una muestra de orina

Materiales:

  • R1 y R2: componentes del reactivo cromógeno; cuando se mezclan en proporción 1:1 el resultado contiene:
    • 100 mM glicilglicina
    • 3 mM γ-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida
    • 100 mM tampón Tris, pH=8.25
  • Muestra de orina en la que se quiere deteminar la actividad enzimática.

Preparación del experimento:

Añade a las tres cubetas 1 mL de R1 y 1 mL de R2, y volúmenes distintos de agua a cada cubeta:

cubeta: 1 2 3  
volumen de R1: mL
volumen de R2: mL
volumen de agua: µL

Calibra el espectrofotómetro tras introducir la cubeta nº 1: ajusta la longitud de onda a 405 nm y pulsa el botón “A=0”. Saca la cubeta.

Medida del curso de la reacción enzimática:

La absorbancia de cada cubeta deberá medirse a intervalos de un minuto durante un total de 10 min, comenzando desde el momento en que se añada la orina. Es posible ir alternando la medida de ambas cubetas (2 y 3, una cada 30 s), de modo que el experimento completo dure 10 min. Si lo prefieres, puedes preparar primero la cubeta nº 2 y hacer todas sus medidas, tras lo cual harás lo mismo con la nº 3; en este caso, se tardarán 20 min.

Prepara en tu cuaderno de laboratorio una tabla donde recopilar los tiempos y las medidas de absorbancia, similar a la que se muestra aquí:

tiempo
(min:s)		 cubeta 2 cubeta 3
0:00 añadir 200 µL de orina
0:30   añadir 400 µL de orina
1:00 A= ...  
1:30   A= ...
2:00 A= ...  
2:30   A= ...
etc.    

El procedimiento será:

Añade la orina a la cubeta 2 (tiempo cero, comienza la reacción); inicia el cronómetro e introduce la cubeta en el espectrofotómetro.

A los 30 s, añade la orina a la cubeta 3 (la reacción comenzará cuando se añada la segunda alícuota completando los 2.4 mL).

Al cumplirse el minuto, pulsa el botón para registrar la lectura de absorbancia en la pantalla inferior. Saca la cubeta nº 2 e introduce la nº 3.

Repite la medida cada 30 s alternando las cubetas. Si el tiempo no fuera exactamente el previsto, anota su valor exacto en tu tabla.

Terminados los 10 min de medidas, pulsa el botón y copia el listado de valores de absorbancia.

Análisis de resultados:

Anota en tu cuaderno de laboratorio el código asignado a tu experimento (en este caso es

Haz una gráfica representando las absorbancias obtenidas en ambas cubetas frente al tiempo de reacción. Ajusta los datos a sendas líneas rectas (una para cada cubeta). A partir de la pendiente de cada recta, calcula la concentración de actividad enzimática en la muestra de orina.

Fundamento:

Reacción catalizada por la enzima, que permite la detección de su actividad:

Coeficiente de extinción molar del 5-amino-2-nitrobenzoato: ε = 9.25·103 mol−1·L·cm−1