Simulación de electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida con SDS

Instrucciones detalladas

Controles generales:

Procedimiento:

	1. Elige una velocidad para la animación (para que se vea de forma cómoda en el ordenador que estés usando)
	2. Elige una muestra
	3. Elige la concentración de acrilamida en el gel
	4. Elige 2 o más patrones, marcando las casillas que hay junto a sus nombres. Puedes consultar su identidad y propiedades pulsando el botón 'Protein Info'.
	5. Elige un voltaje
Añadir patrón	6. Pulsa el botón para cargar los patrones en el primer pocillo.
Añadir muestra	7. Pulsa el botón para cargar la muestra en el segundo pocillo.
Comenzar Detener	8. Pulsa los botones para conectar la corriente y comenzar la electroforesis, y para detenerla antes de que las bandas se salgan por abajo.

Definición de terminología

Acrilamida

El principal monómero constituyente de la poliacrilamida.

Agarosa

Un polímero que forma un gel con poros grandes. Se usa como medio separador para realizar electroforesis de macromoléculas, en especial ácidos nucleicos.

Agentes reductores

Compuestos químicos capaces de reducir los enlaces disulfuro de las proteínas (-S-S-) a grupos sulfhidrilo (-SH). Permiten desplegar completamente una proteína y separar las subunidades de una proteína multimérica; ambos efectos son necesarios para que la movilidad de la proteína en una electroforesis SDS-PAGE sea acorde con su masa molecular. Los más habituales con el beta-mercaptoetanol y el ditiotreitol (DTT).

Ánodo

Electrodo positivo (al que se dirigen los aniones, de carga negativa).

Bisacrilamida

 Nombre común de la N,N'-metilenobis(acrilamida), un monómero constituyente de la poliacrilamida.

Cátodo

Electrodo negativo (al que se dirigen los cationes, de carga positiva).

Corrientes de convección

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Desnaturalizante

Un compuesto químico o una condición física que provocan desnaturalización de las macromoléculas.

Ditiotreitol

treo-2,3-dihidroxi-1,4-butanoditiol. También llamado reactivo de Cleland.
Véase agentes reductores.
Reacción de reducción de disulfuros:

Dodecilsulfato sódico

Compuesto con propiedades detergentes, empleado habitualmente en electroforesis (técnica SDS-PAGE) por su capacidad de desnaturalizar las proteínas y de unirse a ellas en una proporción masa/masa constante. Como resultado, las moléculas de proteína quedan completamente desplegadas y recubiertas de una carga negativa uniforme, y por ello su movilidad electroforética es inversamente proporcional a su número de aminoácidos.
Otros nombres: SDS, laurilsulfato sódico.

DTT

Ditiotreitol.

Electroforesis

Separación de moléculas en disolución mediante aplicación de un campo eléctrico. Dependiendo del soporte empleado, las moléculas se separarán en función de una combinación de su carga eléctrica, su tamaño y su forma.

Electroforesis capilar

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Estructura cuaternaria

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Estructura primaria

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Estructura secundaria

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Estructura terciaria

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Flujo electroosmótico

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Flujo electroforético

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Mercaptoetanol

Más correctamente, beta-mercaptoetanol o 2-mercaptoetanol. Véase agentes reductores.

Masa molecular

La masa de una molécula. Habitualmente se indica sin unidades, referida a la unidad de masa atómica (u.m.a. o dalton, Da), por lo que es más correcto llamarla masa molecular relativa (M_r). El término peso molecular es menos correcto. En el caso de macromoléculas, particularmente proteínas, es frecuente el uso de la masa molecular dividida por mil, expresada entonces como kilodáltones (kDa). Finalmente, la cantidad de sustancia cuya masa en gramos es numéricamente igual a M_r corresponde a un mol de la sustancia.
Ejemplos:

La masa molecular del sulfato de cobre anhidro (CuSO₄) es 159,6 uma = 159,6 Da, o bien su masa molecular relativa es M_r = 159,6. Su masa molar es 159,6 g/mol
La masa molecular de la mioglobina es 17183 Da = 17,2 kDa; su masa molecular relativa es M_r = 17183. Su masa molar es 17183 g/mol

Migración relativa

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Nativo

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Ovillo aleatorio

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Poliacrilamida

Polímero generado a partir de acrilamida y bisacrilamida. Forma un gel con poros más pequeños que la agarosa. Se usa como medio separador para realizar electroforesis de macromoléculas, en especial proteínas y fragmentos de ácidos nucleicos.

Rm

(Relative Mobility) Movilidad relativa. Véase migración relativa.

SDS

(Sodium Dodecyl Sulphate) Dodecilsulfato sódico.

SDS-PAGE

(Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS. El detergente SDS se incluye en la composición del gel y en el tampón de electroforesis, habitualmente en una concentración del 1%. La principal utilidad de esta técnica es la estimación de la masa molecular de proteínas.

Subunidades

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Tampón

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Análisis de resultados

1. Pulsando con el puntero del ratón sobre las bandas en el gel podrás ver arriba la información de cada una. Toma nota de la movilidad relativa de la banda de la muestra problema. Para estimar la masa molecular de la proteína problema:
2. Pulsa el botón Gráfica para mostrar la gráfica de calibrado.
3. En esa gráfica, mueve el puntero del ratón sobre el eje de abscisas; cuando el valor mostrado coincida con la movilidad de la proteína problema (anotada antes), pulsa el botón del ratón. Se trazará la interpolación y podrás leer junto al eje de ordenadas el valor del logaritmo de la masa molecular y en la parte superior esa masa.

Ejercicios

A) Influencia de la diferencia de potencial aplicada

Carga en el gel todos los patrones y una cualquiera de las muestras problema de proteínas.

Elige por turno cada una de las diferencias de potencial (voltajes) disponibles en el simulador y desarrolla la electroforesis hasta que la banda del colorante (color morado) se acerque al extermo inferior del gel. Anota en cada caso la movilidad de las bandas de las proteínas patrón.

1. ¿Cuál es el efecto de aumentar la diferencia de potencial eléctrico entre ambos electrodos?

B) Influencia de la concentración de acrilamida

Carga en el gel todos los patrones y una cualquiera de las muestras problema de proteínas.

Elige por turno cada una de las concentraciones de acrilamida disponibles en el simulador y desarrolla la electroforesis hasta que la banda del colorante (color morado) se acerque al extermo inferior del gel. Anota en cada caso la movilidad de las bandas de las proteínas patrón.

1. ¿Cuál es el efecto de aumentar la concentración de acrilamida que forma el gel?

Al aumentar la concentración de acrilamida, algunos patrones se separan más entre sí, pero otros se separan menos entre sí.
Lo que sí ocurre con todos ellos es que se desplazan menos (aunque para los más pequeños la diferencia es mínima).

2. ¿Cómo lo interpretas, en términos del mecanismo de la separación?

C) Autoevaluación de los resultados de masa molecular

Elige una de las muestras problema de proteínas, incluidas en el simulador.

Carga esa muestra en el gel, así como todos los patrones.

Desarrolla la electroforesis hasta que la banda del colorante (color morado) se acerque al extermo inferior del gel.

Tras acabar, mide la movilidad de la proteína problema e interpola ese valor en la gráfica para obtener su masa molecular relativa.

Para confirmar que tus resultados son correctos:

D) Determinación de estructura cuaternaria

Carga en el gel del simulador todos los patrones y una cualquiera de las muestras problema de proteínas (aunque no la usarás).

Desarrolla la electroforesis hasta que la banda del colorante (color morado) se acerque al extermo inferior del gel.

Tras acabar, accede a la gráfica de masa molecular relativa frente a movilidad y resuelve los siguientes problemas:

1. Una enzima tratada con SDS y beta-mercaptoetanol se analiza en un gel de poliacrilamida con SDS, observándose 2 bandas con una movilidad relativa de 0,47 y 0,59.
Gracias a experimentos independientes, usando cromatografía de exclusión y ultracentrifugación, se ha determinado que la masa molecular de la enzima nativa es de 128 000.
Empleando la recta de calibrado obtenida en el simulador, estima la masa molecular de ambas subunidades de la enzima y deduce cuál es su estructura cuaternaria.

2. Una proteína tratada con SDS pero sin beta-mercaptoetanol se analiza en un gel de poliacrilamida con SDS, observándose una sola banda con una movilidad relativa de 0,21.
Cuando la proteína se trata previamente con SDS y beta-mercaptoetanol, la electroforesis muestra dos bandas, de movilidades 0,48 y 0,61.
Empleando la recta de calibrado obtenida en el simulador, interpreta los resultados.

3. (Avanzado) Si la proteína se trata previamente con tripsina, se obtiene la misma banda en ausencia de beta-mercaptoetanol, pero cuatro bandas en su presencia. Explica estos resultados.