15.2 Frecuencia de corte y tamaño de los fragmentos de restricción

La frecuencia con la que una enzima de restricción cortará una molécula aleatoria de DNA depende del tamaño de la diana. Esto es así pues, por azar, es más probable encontrar una secuencia corta que una larga.

tamaño de la secuencia diana de restricción	estadísticamente, aparecería ¿? ¿Por qué 4ⁿ? La probablidad de un nucleótido determinado en una posición es de 1/4. La probabilidad de que el siguiente sea otro determinado es, de nuevo, 1/4. Por tanto, la probabilidad de encontrar una cierta secuencia de 2 nucleótidos es de 1/16. Y así sucesivamente. Es decir, la probabilidad de encontrar en un punto dado una cierta secuencia de n nucleótidos es de (1/4)ⁿ. una diana cada:	tamaño teórico medio de los fragmentos	nº teórico de dianas ¿? ¿Cómo se calcula? Dividiendo el nº de pb del genoma (3,2 · 10⁹ o 4,6 · 10⁶) entre el tamaño medio de los fragmentos. en el genoma
tamaño de la secuencia diana de restricción		tamaño teórico medio de los fragmentos	haploide humano	E. coli
4 pb	4⁴ = 256 pb	256 pb	13 · 10⁶	18 000
6 pb	4⁶ = 4 096 pb	4 096 pb	8 · 10⁵	1 100
8 pb	4⁸ = 65 536 pb	65 536 pb	5 · 10⁴	70
pb	calcular		1¹

Se han encontrado unas pocas enzimas de restricción con dianas de más de 6 pb; debido a que su frecuencia de corte es muy inferior a las habituales, se las denomina enzimas cortadoras infrecuentes y poseen utilidad en algunas situaciones, como la elaboración de genotecas [ampliar].

En la preparación de una genotea (pág. 234), si la enzima corta en numerosos puntos, se generan muchos fragmentos que será necesario clonar por separado. Manejar un número elevado de clones es inconveniente y, además, la reconstrucción posterior de la secuencia completa a partir de la de los fragmentos es mucho más difícil. Es más conveniente una enzima que corte en no muchos fragmentos, que con más facilidad se clonan y se alinean sus secuencias.

En realidad, la frecuencia suele ser inferior a la calculada teóricamente, debido a varias causas. Por un lado, la distribución de bases en el genoma no es totalmente aleatoria, lo que conduce a fragmentos cuya longitud media puede desviarse de las cifras indicadas. Por ejemplo, el dinucleótido CG es poco frcuente en el DNA humano (y de los mamíferos en general), por lo que enzimas como Hpa II (con diana C^CGG), Pvu I (CGAT^CG) y Not I (GC^GGCCGC) producen menos —y mayores— fragmentos de lo esperado. Además, en las regiones donde se concentran las secuencias CG éstas suelen estar metiladas (islotes CpG, pág. 278), lo que las hace insensibles a las enzimas de restricción (pág. 211) y reduce aún más el número de sitios de corte en el genoma. Como ilustración de esta disparidad cabe citar que los fragmentos de DNA humano varían entre los 300 pb en promedio obtenidos con Alu I (diana de 4 pb) y los 9,7 Mb para Not I (diana de 8 pb).