21.3 Estrategia experimental para discernir la especificidad entre codones, tRNA y aminoácido

El establecimiento de los mecanismos de reconocimiento y de la correspondencia entre cada aminoácido y uno solo o unos pocos tRNA, así como el emparejameinto entre tRNA y mRNA, ha requerido diseños experimentales adecuados.

Modificación de un aminoacil-tRNA: experimento de Benzer

Un ejemplo ya clásico (Seymour Benzer y col., 1962) es el tratamiento del cisteinil–tRNA con hidruro de níquel.

El hidruro de níquel conduce a la pérdida del grupo tiol de la cisteína, rindiendo alanina:

A partir de un RNA mensajero ...AGGAAUGGCCUUAUGCGGC... y añadiendo al ensayo lo siguiente:
experimento nº 1:
Cys		 experimento nº 2:
Cys		 experimento nº 3:
Cys
+ NiH2 + tRNACys
+ tRNACys + tRNACys + NiH2
traducción traducción traducción
se obtiene   (pulse en los enlaces `traducción´)

Ayuda: código genético

¿Cómo se explican estos resultados y qué aportan al conocimiento de los mecanismos de interacción del tRNA con el aminoácido y con el codón?

Ayuda 1

De acuerdo con el código genético, para interpretar qué proteína está codificada en ese tramo de mRNA debemos buscar el codón de inicio y separar los codones: ...AGGA AUG GCC UUA UGC GGC ...
lo que codifica esta secuencia peptídica: Met-Ala-Leu-Cys-Gly...  El codón correspondiente a la cisteína es el UGC (su tRNA específico tendrá un anticodón 3'-ACG-5').

Ayuda 2

En el experimento nº 2, el hidruro de níquel habrá transformado la cisteína en alanina. Dado que se obtiene la misma proteína que en el experimento nº 1, debemos interpretar que el sistema empleado para hacer la traducción (celular o bien in vitro) dispone de cisteína aparte de la que se ha modificado en la reacción. Dicho esto, la interpretación del resultado indica que el tRNA específico de cisteína no es capaz, lógicamente, de unirse a la alanina y luego incorporarla a la cadena polipeptídica que se sintetiza.

Ayuda 3

En el experimento nº 3, la reacción con el hidruro de níquel ha tenido lugar después de que la cisteína esté unida al tRNA (es decir, activada como cisteinil–tRNA). Previsiblemente, el cisteinil–tRNA se convierte en alanil–tRNA, pero este tRNA sigue siendo el específico de cisteína, es decir, Ala–tRNACys, con el anticodón 3'-ACG-5' propio de la cisteína.
El resultado observado en el polipéptido es la incorporación de alanina en la posición que correspondía a cisteína. Esto indica que la interacción del aminoacil-tRNA con el mensajero (interacción anticodón-codón) es completamente independiente de cuál sea el aminoácido que está unido al tRNA.
Es decir, la aplicación del código genético depende exclusivamente de la aminoacil-tRNA sintetasa, que reconoce específicamente un aminoácido y un tRNA, en una etapa previa e independiente de la interacción del tRNA con el mRNA, que sólo depende ya del emparejamiento codón-anticodón.

Modificación de un tRNA

En E. coli, el tRNA específico para cisteína (tRNACys) posee en su brazo aceptor del aminoácido un par de bases C•G (C3 - G70 según su posición en la secuencia). Se ha podido preparar un tRNA alterado introduciendo dos cambios: en posición 3 una G y en posición 70 una U (el par G•U es uno de los pares atípicos).

A partir de un RNA mensajero ...AGGAAUGGCCUUAUGCGGC... y añadiendo al ensayo lo siguiente:
experimento nº 1: experimento nº 2:
+ tRNACys normal + tRNACys modificado C3G, G70U
traducción traducción
se obtiene   (pulse en los enlaces `traducción´)

¿Cómo se explican estos resultados y qué aportan al conocimiento de los mecanismos de interacción del tRNA con el aminoácido y con el codón?

Ayuda

En el experimento nº 2, el tRNA específico para cisteína se ha unido con alanina. Esto se debe a que el par G•U en la tercera posición del brazo aceptor es una característica singular del tRNAAla y, como tal, responsable de su reconocimiento por la alanil-tRNA sintetasa (AlaRS). En consecuencia, la AlaRS reconoce como sustrato al tRNACys modificado y le une covalentemente su otro sustrato, la alanina. Puesto que el anticodón no se ha visto alterado, al incorporarse al ribosoma en la traducción el tRNA se empareja con el codón UGC propio de cisteína, pero aportando alanina a la cadena polipeptídica que se está formando.
De nuevo se manifiesta que es la especificidad de las aminoacil-tRNA sintesasas la responsable de la aplicación del código genético.

Modificación de un anticodón

El tRNA específico para valina (tRNAVal) posee un anticodón 5'-UAC-3'. Se ha podido preparar un tRNA alterado, en este caso introduciendo dos cambios en el anticodón para que pase a ser 5'-CAU-3'.

En este caso, el anticodón es la zona del tRNA que reconoce la MetRS. Por ello, el tRNAVal modificado U34C, C36U se une a MetRS (en lugar de a ValRS) y, en consecuencia, quedará cargado con metionina y no con valina (Met–tRNAVal). Ahora bien, como el anticodón es también responsable de la interacción con el mRNA, este tRNA no se asociará a los codones GUA propios de valina, sino a los AUG propios de metionina. Es decir, el tRNAVal alterado actúa como otro tRNAMet: introduce residuos de metionina en las posiciones donde haya codones AUG.