20.1 Experimentos de determinación del código genético
El descifrado del código se pudo realizar principalmente mediante experimentos de traducción in vitro a partir de cadenas de polinucleótido sintéticas con secuencias muy simples y repetitivas. El conocimiento de la secuencia suministrada al sistema permitió interpretar los resultados e ir asignando un aminoácido concreto a cada triplete de nucleótidos.
Ensayo con homopolímeros
La necesidad de un triplete para codificar un aminoácido se demostró inicialmente in vitro con el empleo de dos tipos de componentes:
- Un extracto libre de células (inicialmente de E. coli o de reticulocitos de conejo, llamado “extracto S-30”), que aporta los componentes necesarios para que se desarrolle la síntesis proteica, a excepción del mRNA.
- Un homopolirribonucleótido sintético, por ejemplo poli–U, obtenido por catálisis con polinucleótido fosforilasa a partir de UDP y un cebador, sin necesidad de molde.
RNA cebador
+
polinucleótido fosforilasan NDP
(UDP como ejemplo)
molécula de tipo RNA
(poli-U) + n Pi
Al añadir este polirribonucleótido al extracto acelular (S-30) se constituye un sistema de traducción in vitro, que produce un homopolipéptido. Si se emplean aminoácidos marcados con isótopos radiactivos se puede averiguar cuál es el polipéptido obtenido.
Partiendo de:
extracto S-30 + Mg2+ + GTP + ATP +
+ los 20 aa + [14C]
| se obtiene este resultado: |
|
Explicación de las conclusiones que se extraen de este experimento.
Por ejemplo, a partir de poli(U) el único tubo donde aparece radiactividad precipitable (proteína) es el que recibió marcada la fenilalanina. De esto se deduce que se ha formado el homopolipéptido poli(Phe), por lo que Phe debe ser el aminoácido codificado por el triplete UUU. Ello se confirma por la ausencia de radiactividad al añadir [14C] a las muestras de poli(C), poli(G) o poli(A).
Similarmente:
- A partir de poliuridinilato se sintetiza polifenilalanina: UUU codifica Phe
- A partir de policitidilato se sintetiza poliprolina: CCC codifica Pro
- A partir de poliguanilato se sintetiza poliglicina: GGG codifica Gly
- A partir de poliadenilato se sintetiza polilisina: UUU codifica Lys
Los experimentos anteriores sólo permiten descifrar algunos codones muy particulares; para desvelar la correspondencia entre los demás codones y los aminoácidos se emplearon polirribonucleótidos con secuencias repetidas de dos, tres o cuatro bases, que conducen a la síntesis de polipéptidos con uno o unos pocos aminoácidos en patrones repetitivos.
Ensayo con secuencias repetidas de dos nucleótidos
Por replicación de una hebra de DNA sintético con secuencia dinucleotídica repetida se forma un solo tipo de polipéptido, con dos aminoácidos alternantes (comenzando por uno o bien por el otro):
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Se concluye que los tripletes UCU y CUC codifican Leu y Ser, o viceversa; con este ensayo no se puede definir la correspondencia de cada uno. Fueron experimentos posteriores los que demostraron que UCU codifica Ser y CUC codifica Leu.
Ensayo con secuencias repetidas de tres nucleótidos
Para simplificar, se representa a partir de ahora ya directamente el mRNA. A partir de un polímero con secuencia trinucleotídica repetida se obtiene una mezcla de 3 homopolipéptidos:
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Se establece, pues, la correspondencia entre Tyr, Thr y Leu con UAC, ACU y CUA, de nuevo sin poder definir cuál de los codones codifica cada uno de los 3 aminoácidos.
Ensayos con secuencias repetidas de cuatro nucleótidos
A partir de un polímero con secuencia tetranucleotídica repetida se obtiene un solo polipéptido, aunque comienza por puntos diferentes:
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El mismo planteamiento experimental puede extenderse a otras secuencias repetitivas (de 5, 6, etc., nucleótidos), observándose siempre la correspondencia entre un triplete y un aminoácido. Estudiando así la síntesis de un gran número de mRNA sintéticos se pudo descifrar la asignación concreta de otros tripletes (codones), a la vez que se descubrió la degeneración del código (pág. 314).