16.2 Selección de las células híbridas empleando medio HAT

El método de selección de los híbridos, es decir, la forma de conseguir que en cultivo sólo sobrevivan estas células, es un aspecto sumamente importante para la cartografía mediante células somáticas híbridas. El sistema de selección más utilizado hace uso del medio HAT, así llamado por contener hipoxantina, aminopterina y timidina. (Este mismo método se emplea en la preparación de anticuerpos monoclonales y en la selección de clones recombinantes)

Fundamento metabólico del uso de medio HAT

Su misión es bloquear la principal ruta de síntesis de nucleótidos, la denominada vía de novo, al tiempo que favorece la ruta alternativa, vía de recuperación.

Pulsando sobre las flechas rojas se muestra la explicación de cómo actúa cada componente.

El medio HAT aporta hipoxantina, lo que refuerza la ruta de recuperación de purinas (reacción en verde).
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El medio HAT aporta aminopterina, análogo del tetrahidrofolato que bloquea la reactivación de éste y así, indirectamente, la síntesis de novo (etapas señaladas con \\).
También se utiliza en su lugar ametopterina (metotrexato); ambos se llaman agentes antifólicos.
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El medio HAT aporta timidina, lo que refuerza la ruta de recuperación de pirimidinas (reacción en verde).
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Consecuencias del cultivo de las células en medio HAT

Para que el medio HAT sea eficaz se requiere que la fusión de células humanas se realice con líneas de roedor mutantes, deficientes en la actividad enzimática HGPRT, actividad esencial para la vía de recuperación. Las células de roedor dependen, pues, de la vía de novo, que las células normales no utilizan habitualmente. De esta forma, en la célula híbrida se complementa la capacidad de proliferación propia de la célula de roedor con la capacidad de crecimiento en medio HAT aportada por la presencia de material genético humano (que sí posee el gen de la enzima HGPRT normal).

Tipo de célula Utilización de las rutas metabólicas y, como consecuencia, crecimiento en cultivo
en medio normal en medio HAT
Célula humana o de roedor normales

No prolifera bien en cultivo.
Posee actividad HGPRT.		 Vía de novo sí no, bloqueada por A
Vía de recuperación sí sí, favorecida por H y T
Crecimiento en cultivo no
(característica
del tipo celular)
 no
(característica
del tipo celular)
Línea celular de roedor especial para fusión

Prolifera fácilmente en cultivo.
Mutante HGPRT− (carece de esa actividad enzimática).		 Vía de novo sí no, bloqueada por A
Vía de recuperación no, por falta de HGPRT no, por falta de HGPRT
Crecimiento en cultivo sí
(característica
del tipo celular)
 no,
por falta de
nucleótidos
Célula híbrida resultante de la fusión

Combina la capacidad de proliferar en cultivo de la de roedor y la actividad enzimática HGPRT de la humana		 Vía de novo sí no, bloqueada por A
Vía de recuperación sí sí, favorecida por H y T
Crecimiento en cultivo sí
 sí
Conclusiones: El medio normal no permite la selección Gracias al medio HAT se seleccionan las células híbridas