Ensayo de citotoxicidad

Usando como diluyente el medio de cultivo celular, prepara disoluciones de H₂O₂ de concentraciones mM. Para el experimento se necesitarán al menos 1.5 mL de cada una.

Material:

Procedimiento:

Cada disolución se debe preparar por dilución de la anterior, de forma que su concentración sea la deseada y que haya suficiente cantidad para preparar la siguiente y para emplear en el experimento tres alícuotas de 500 µL cada una (y que sobre algo más).

2ª parte: Ensayo del MTT (viabilidad metabólica)

Fundamento

Material:

Placa de 24 pocillos con células PC3 adheridas al fondo de los pocillos.
Micropipetas y puntas estériles.
Disoluciones de H₂O₂ preparadas anteriormente.
Disoluciòn 0.5 g/L de MTT, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, en medio RMPI.
Disolución 0.2% de SDS (dodecilsulfato sódico).
Dimetilsulfóxido (DMSO)
Medio de cultivo celular atemperado a 37°C: medio RPMI al que se le ha añadido 10% de suero bovino fetal y 1% de antibióticos.

Tratamientos:

Control negativo de citotoxicidad (⊖): sin H₂O₂
Control positivo de citotoxicidad (⊕): con SDS 0.2%
Ensayo: con diferentes concentraciones de H₂O₂
Todo se ensaya por triplicado.
mostrar una posible distribución de tratamientos en la placa. Anota en tu cuaderno de laboratorio ésta u otra que decidas.

Instrucciones para usar el laboratorio virtual

Pulsa en el tubo del que quieras tomar líquido y la micropipeta se moverá hasta él y aspirará. (Si te equivocas, pulsa en el cubo de residuos para eliminar la punta y su contenido.) Para dispensar el contenido de la pipeta, pulsa en el pocillo de la placa donde quieras añadirlo.

Procedimiento:

Para comenzar, el medio de cultivo de los pocillos (basta con volcar la placa y escurrir bien el líquido).
Añade a cada pocillo 500 µL de una de las disoluciones de tratamiento: medio (⊖), SDS (⊕) o H₂O₂ de acuerdo con la distribución planificada.
durante 30 minutos en la estufa de cultivos celulares (5% CO₂, 95% aire, 90% humedad, 37°C).
el contenido de los pocillos.
Añade a cada uno 500 µL de la disolución de MTT.
durante 2 h para que tenga lugar la reacción de reducción del MTT.
el contenido de los pocillos.
Añade a cada uno 500 µL de DMSO, que disolverá el formazano coloreado.
la absorbancia a 570 nm en el lector de placas.
Copia los resultados y prepara a partir de ellos una gráfica representando el % de viabilidad frente a la concentración de H₂O₂ del tratamiento (usa escala logarítmica para la concentración).