Determinación de colesterol

reacción abreviada del colesterol con fenol y aminofenazona para dar una quinonaimina de color rosa

El objetivo de esta página es practicar los cálculos.

Reactivos:

Disolución patrón con 2 g/L de colesterol.
Disolución salina isotónica: NaCl 0.15 M
Disolución con heparina 14.5 g/L y MnCl₂ 1 M
Disolución para la reacción enzimática, que contiene:
- fenol 28 mM
- 4-aminofenazona 0.5 mM
- colato sódico 0.5 mM (tensioactvo y detergente)
- colesterol esterasa, 200 U/L
- colesterol oxidasa, 100 U/L
- peroxidasa, 800 U/lL
- tampón PIPES 35 mM, pH=7.0

1. Cálculos del patrón

Se preparan tres tubos con el patrón por triplicado, con una misma concentración conocida de colesterol.

Calcula la concentración de colesterol en la mezcla final de cada tubo, escribe los resultados en la última columna y

Una vez lo hayas hecho correctamente, aparecerá una columna más con valores de absorbancia; utiliza los que se proporcionan o escribe los tuyos.

tubo nº	volumen de disolución patrón (µL)	volumen de d.salina (µL)	volumen del reactivo con enzimas (mL)
0	0	1000	2.0
1	30	975	2.0
2	30	975	2.0
3	30	975	2.0

Calcula el valor promedio de absorbancia de los tubos patrón: y

2. Cálculo de la concentración en las muestras

Se ensayará una sola muestra de suero.

Una parte de la muestra se somete a un proceso previo para retirar las lipoproteínas LDL y VLDL mediante precipitación con heparina y Mn²⁺ :

tubo	volumen de suero (µL)	volumen de d.salina (µL)	volumen de reactivo heparina y Mn²⁺(µL)	➜➜
A	300	300	60
B	0	600	60		A	B

y se recupera el sobrenadante de cada tubo para usarlo como muestra en el ensayo espectrofotométrico.

Utiliza los valores de absorbancia que se proporcionan o escribe los tuyos. Luego calcula, a partir de los resultados del patrón, la concentración de colesterol en cada uno de los tubos, escribe sus valores en la última columna y

tubo nº	muestra	volumen de muestra (µL)	volumen de d.salina (µL)	volumen del reactivo con enzimas (mL)
4	suero	20	980	2.0
5	sobrenadante de A	400	600	2.0
6	sobrenadante de B	400	600	2.0

(El colesterol total se obtiene a partir del ensayo del tubo 4; el asociado a HDL, a partir del tubo 5, resultado de la precipitación;
recuerda tener en cuenta en los cálculos el resultado del tubo 6)

Para terminar, escribe a continuación el valor de concentración de colesterol en el suero del que se partió, expresándolo en mg/dL (unidades habituales en la clínica para la colesterolemia):
suero: c_{colesterol total} = mg/dL
suero: c_{colesterol asocidado a HDL} = mg/dL
y