Cálculos con absorbancia y concentración

Método general:

Lo que tienes que tener muy claro: para un mismo espesor de muestra, paso óptico o anchura de la cubeta,

la absorbancia es proporcional a la concentración.

En consecuencia, se pueden establecer proporciones directas entre A y c. (Habitualmente usamos siempre cubetas de 1 cm de paso óptico)

Por ello, los problemas se pueden resolver mediante una regla de tres (pero bien planteada: la absorbancia de una muestra es proporcional a la concentración en esa muestra del compuesto que absorbe, y la constante de proporcionalidad es siempre la misma para un compuesto dado; a mayor concentración, mayor absorbancia).

También (en el fondo, es lo mismo) se puede plantear

A = a b c	o bien	A = c
A = absorbancia a una longitud de onda dada, a = absortividad = = coeficiente de extinción, a esa b = = paso óptico o espesor de la muestra c = concentración del compuesto que absorbe Si c es una concentración molar (se mide en moles/volumen), a y se llaman absortividad molar y coeficiente de extinción molar.

1.

Una disolución 15 mM de un colorante azul tiene una absorbancia de 0.600. ¿Cuál es la concentración de una muestra del mismo colorante cuya absorbancia es 0.400?

Método 1: por proporcionalidad
(podría hacerse con una regla de tres)

Puesto que A = abc , y a y b son constantes:

A₁

c₁

A₂

c₂

Es decir:

0.600

15 mM

0.400

y c = 15 mM · 0.4 / 0.6 = 10 mM

Método 2: calculando la absortividad o coeficiente de extinción

A = abc , entonces para la disolución de referencia: 0.600 = ab·15 mM
luego ab = 0.6/15 mM⁻¹ = 0.04 mM⁻¹ (si el paso óptico fuera de 1 cm, el valor de absortividad molar sería 0.04 mM⁻¹ cm⁻¹).

Aplicándolo a la disolución problema:
A = abc 0.400 = 0.04 mM⁻¹ · c c = 0.4/0.04 mM = 10 mM

2.

Un compuesto de color rojo disuelto a 0.10 M tiene una absorbancia de 1.20. ¿Cuál es la concentración de una muestra del mismo compuesto cuya absorbancia es 0.90?

Método 1: por proporcionalidad
(podría hacerse con una regla de tres)

Puesto que A = abc , y a y b son constantes:

A₁

c₁

A₂

c₂

Es decir:

1.20

0.10 M

0.90

y c = 0.10 M · 0.9 / 1.2 = 0.075 M que se expresa mejor así: 75 mM

Método 2: calculando la absortividad o coeficiente de extinción

A = abc , entonces para la disolución de referencia: 1.20 = ab·0.10 M
luego ab = 1.2/0.10 M⁻¹ = 12 M⁻¹ (si el paso óptico fuera de 1 cm, el valor de absortividad molar sería 12 M⁻¹cm⁻¹).

Aplicándolo a la disolución problema:
A = abc 0.90 = 12 M⁻¹ · c c = 0.9/12 M = 0.075 M = 75 mM

3.

Una disolución con 5 mg/mL de una proteína coloreada tiene una absorbancia de 0.250. ¿Cuál es la concentración de una muestra de esa proteína cuya absorbancia es 0.90?

Método 1: por proporcionalidad
(podría hacerse con una regla de tres)

Puesto que A = abc , y a y b son constantes:

A₁

c₁

A₂

c₂

Es decir:

0.250

5 mg/mL

0.90

y c = 5 mg/mL · 0.9 / 0.25 = 18 mg/mL

Método 2: calculando la absortividad o coeficiente de extinción

A = abc , entonces para la disolución de referencia: 0.250 = ab·5 mg/mL
luego ab = 0.25/5 mg⁻¹·mL = 0.05 mg⁻¹·mL (si el paso óptico fuera de 1 cm, el valor de absortividad sería 0.05 mg⁻¹·mL·cm⁻¹).

Aplicándolo a la disolución problema:
A = abc 0.90 = 0.05 mg⁻¹·mL · c c = 0.9/0.05 mg/mL = 18 mg/mL

4.

Una muestra se diluye añadiendo 20 µL a 780 µL de agua. Su absorbancia es entonces de 0.950. Una muestra patrón del mismo compuesto 3.0 mM da una absorbancia de 0.475. ¿Cuál es la concentración de la muestra problema?

Lo primero es calcular la dilución efectuada:
c₁V₁ = c₂V₂

c₁ · 20 µL = c₂ · (780+20) µL

c₁/c₂ = 800/20 = 40
(usando el subíndice "1" para la muestra original y el "2" para la diluida)

A continuación, tenemos en cuenta la absorbancia:

Método 1: por proporcionalidad

A₂

c₂

A_p

c_p

(donde el subíndice "p" hace referencia a la disolución patrón)

Es decir:

0.950

c₂

0.475

3.0 mM

o sea, c₂ = 3 mM · 0.95 / 0.475 = 6 mM
entonces, considerando la dilución: c₁ = 40 · c₂ = 240 mM

Método 2: calculando la absortividad o coeficiente de extinción

A = abc , entonces para la disolución de referencia: 0.475 = ab·3.0 mM
luego ab = 0.475/3 mM⁻¹ = 0.125 mM⁻¹ (si el paso óptico fuera de 1 cm, el valor de absortividad molar sería 0.125 mM⁻¹cm⁻¹).

Aplicándolo a la disolución problema:
A = abc 0.950 = 0.125 mM⁻¹ · c₂ c₂ = 0.95/0.125 mM = 6 mM

Y, considerando la dilución: c₁ = 40 · c₂ = 240 mM

5.

Se mide la velocidad de una reacción mediante la producción de un compuesto coloreado, encontrando que aumenta la absorbancia a una tasa de 0.72 unidades por minuto. Si una disolución 25 µM del compuesto puro da una absorbancia de 0.36, ¿cuál es la velocidad de la reacción en unidades de concentración?

La velocidad de una reacción mide la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. El hecho de que se exprese por unidad de tiempo (min) no afecta para nada a la conversión entre absorbancia y concentración.

A₁

c₁

A₂

c₂

Es decir:

0.36

25 µM

0.72

c₂

o sea, c₂ = 25 µM · 0.72 / 0.36 = 50 µM
Puesto que 0.72 no era exactamente una medida de absorbancia, sino su aumento por minuto, lo que hemos calculado es el aumento por minuto de la concentración del compuesto coloreado (el producto de la reacción), por tanto, es la velocidad de la reacción:

v = 50 µM/min

O, si lo prefieres de un modo más formal:
A = ab · c , entonces también dA/dt = ab · dc/dt , luego:

A₁

c₁

= ab =

dA₂/dt

dc₂/dt

y dc/dt es, por definición, la velocidad de la reacción.

6.

Una reacción produce en 6 minutos un color de 0.90 unidades de absorbancia. Si se sabe que una disolución con 10 mg/mL del producto da una absorbancia de 0.50, ¿cuál es la velocidad de la reacción en unidades de concentración?

A₁

c₁

A₂

c₂

Es decir:

0.50

10 mg/mL

0.90

c₂

o sea, c₂ = 10 mg/mL · 0.90 / 0.50 = 18 mg/mL
Puesto que 0.90 era el aumento de absorbancia en 6 min, la velocidad de la reacción (aumento por minuto de la concentración del compuesto coloreado, que es el producto de la reacción) será:

v = 18 mg/mL / 6 min = 3 mg·mL⁻¹·min⁻¹

O, si lo prefieres de un modo más formal:
A = ab · c , entonces también dA/dt = ab · dc/dt , luego:

A₁

c₁

= ab =

dA₂/dt

dc₂/dt

dA₂/dt

es decir, v =

dA₂/dt

A₁/ c₁

(recuerda: "1" es el patrón, "2" la muestra)

7.

Se realiza una reacción para la cual se mezclan 100 µl de disolución 48 mM de sustrato, 50 µl de muestra que contiene la enzima y 650 µl de tampón. Cuando comienza la reacción, la absorbancia es de 1.20, y en los siguientes 12 minutos disminuye hasta 0.90. Calcula la velocidad de la reacción (en unidades de concentración).

La medida de absorbancia a tiempo cero (justo antes de comenzar la reacción) nos permite establecer la proporción entre absorbancia y concentración del sustrato. La velocidad de la reacción es la velocidad a la que disminuye la concentración del sustrato.

La velocidad es la disminución de concentración de sustrato a lo largo del tiempo, es decir:

v = dc/dt

Y para conocer la concentración acudiremos a la absorbancia.
Calculemos cuánto se ha diluido el sustrato al hacer la mezcla de reacción:

c₁V₁ = c₂V₂

la situación (1) es antes de la dilución (disolución de partida),
la situación (2) es tras la dilución (mezcla de reacción).

V₁ = cuánta disolución de partida se ha añadido
c₁ = concentración de la de partida
c₂ = concentración final en la mezcla
V₂ = volumen total de mezcla

c₂ es la incógnita, las otras variables son conocidas:

c₁ = 48 mM
V₁ = 100 µL
V₂ = 100 µL + 50 µL + 650 µL = 800 µL

c₂ = (c₁V₁) / V₂
c₂ = (48 mM · 100 µL) / 800 µL = 48/8 mM = 6 mM
Esa concentración corresponde a la absorbancia al comienzo de la reacción:

A = ab · c

1.20 = ab · 6 mM
ab = 0.2 mM⁻¹

Entonces, a los 12 minutos de reacción:

A = ab · c

0.90 = 0.2 mM⁻¹ · c
c = 4.5 mM

La disminución de concentración ha sido, pues, de 1.5 mM en 12 min, luego la velocidad será:

v = 1.5 mM / 12 min = 0.125 mM/min

8.

Una muestra 0.2 M se diluye 40 veces, ofreciendo entonces una absorbancia de 0.81. Este compuesto se consume en una reacción a una tasa de 0.09 unidades de absorbancia por segundo.

a) Calcula la velocidad de la reacción (en unidades de concentración).

La concentración al comienzo de la reacción es de 0.2 M / 40 = 200 mM / 40 = 5 mM. Su absorbancia es conocida, por lo que podemos establecer la relación entre ambas magnitudes:

A = ab · c

0.81 = ab · 5 mM
ab = 0.81/5 mM⁻¹

(no necesitamos calcular por ahora el resultado -recuerda que acordamos que no necesitabas calculadora-)
La disminución de absorbancia se puede así transformar en disminución de concentración:

dA/dt = ab · dc/dt = ab · v

Entonces:

v =

dA/dt

0.09 s⁻¹

0.81/5 mM⁻¹

9 · 5

mM/s =

mM/s = 0.55 mM/s

b) Si esa reacción es el resultado de una catálisis enzimática, indica el valor de la concentración de actividad enzimática presente, en unidades internacionales y en unidades del S.I.

   La actividad enzimática (cantidad de enzima, medida a través de su acción catalítica) se mide como velocidad de la reacción en presencia de la enzima.
   Las "unidades internacionales" para la actividad enzimática son mol/min (se indican como U o UI).
   La unidad del S.I. para la actividad enzimática (como para la velocidad de la reacción) es el catal (o katal), correspondiente a 1 mol/s. (Se abrevia kat.)

La concentración de actividad enzimática es la velocidad de la reacción. El problema es, simplemente un cambio de unidades.

[AE] = v = 0.55 mM/s = 0.55 mM/s · ( 1000 µM / 1 mM ) · ( 60 s / 1 min ) = 0.55·100/6 µM/min = 9.17 U/L

(unidades internacionales, 1 U = 1 µmol/min)

[AE] = v = 0.55 mM/s = 0.55 mM/s · ( 1 M / 1000 mM ) = 5.5·10^-4 M/s = 5.5·10^-4 kat/L = 0.55 mkat/L = 550 µkat/L

(unidades S.I., 1 kat = 1 mol/s)

Nota: la AE se mide en moles por unidad de tiempo, la concentración de AE en molar por unidad de tiempo; por eso, AE se mide en U / litro o kat / litro.

9.

Tienes una disolución 150 mM del compuesto DCPIP, cuya absorbancia es demasiado alta para poderla medir con precisión. Por ello, la diluyes 5 veces, consiguiendo una lectura de absorbancia de 1.5 a 600 nm. Calcula la concentración de una muestra de DCPIP cuya A₆₀₀ = 0.5

Puesto que la absorbancia de la muestra es un tercio de la del patrón, la cncentración de la muestra debe ser un tercio de la del patrón; pero ese patrón estaba diluido 1/5, es decir, su concentración al medirlo era de 150/5=30 mM.
Por tanto, la concentración de la muestra problema es 30/3 = 10 mM.

Sea "1" la disolución patrón orginal (150 mM), "2" la dilución que se hizo de ella para medir, y "3" la muestra problema. Entonces:

c₁·V₁ = c₂·V₂ c₂ = c₁·V₁/V₂ = c₁· 1/5 = 30 mM

A₂ / c₂ = A₃ / c₃ c₃ = A₃ / A₂ · c₂ = 0.5 / 1.5 · 30 mM = 1 / 3 · 30 mM = 10 mM