ADN en Medicina Legal:
Grupo de Problemas no 2
Problema 4: Más sobre análisis de VNTR
¿Cuál de los siguientes NO es parte de los
métodos usados para el análisis, con sonda de locus único,
de regiones VNTR en el ADN humano?
Guía
Una sonda de locus único para las regiones VNTR
del ADN utiliza la técnica de hibridación de Southern para
analizar regiones polimórficas del ADN humano. Las etapas experimentales
que se emplean en un laboratorio legal para este análisis son las
siguientes:
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1. Extracción del ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles
fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido
de una víctima muerta, células del folículo capilar
y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios"
o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras
de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre. |
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2. Digestión del ADN con una endonucleasa
de restricción
El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa
de restricción, que es una enzima que corta el ADN dicatenario en
donde tenga una seuencia característica. La enzima que se usa más
frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN
en la secuencia 5'-GGCC-3'. |
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3. Electroforesis en gel de agarosa
Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes
se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles
de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que
poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las
moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida
por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven
más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor
tamaño. Como resultado, se produce una separación continua
de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los
fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia
al origen o punto de aplicaión de la muestra. |
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4. Preparación de un ensayo de Southern
("Southern blot")
Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan
mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una
disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta,
el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana
de nailon, realizando así una copia o "calco" (la traducción
más literal del inglés blot, conservando este sentido,
es "secante"). Este proceso de desnaturalización y transferencia
se conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo inventó,
Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel
con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del
papel al secante, el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon
conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida
en el gel como resultado de la electroforesis. |
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5. Hibridación con sonda radiactiva
Una sonda de locus único es una molécula pequeña
de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN
o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en
el ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria
(dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre
las secuencias de la sonda y del ADN presente en el "calco". Las sondas
de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo
para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus
genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo
de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución
que contiene una sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones
de temeratura y concentración de sales que favorezcan la hibridación.
Tras producirse ésta, se lava el exceso de sonda no unido,
de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon
sea la asociada al ADN del locus diana. |
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6. Detección de los RFLPs mediante
autorradiografía
Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la
membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía.
En esta técnica, la membrana de nailon se coloca, una vez lavada,
junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle
de la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración
radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico,
el registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como
autorradiografía ( abreviado coloquialmente en inglés a "autorad"). |
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7. Reensayar el resultado del Southern con
sondas adicionales
En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos
de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía
para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución
a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una
segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así
las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías
de una misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN". |
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El
Proyecto Biológico
University of Arizona
Tuesday, August 20, 1996
Traducido en Marzo 2004
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