ADN en Medicina Legal:
Grupo de Problemas no 1

Problema 1: Técnica de hibridación de Southern

El análisis de la "huella dactilar de ADN" se basa en la técnica de transferencia e hibridación de Southern. En ésta:

Guía

La huella dactilar de ADN, también conocida como análisis del perfil de ADN, se basa en el uso de la técnica de transferencia e hibridación de Southern para analizar regiones polimórficas del ADN humano. Los polimorfismos se explican con mayor detalle en el problema nº 5. Las etapas experimentales empleadas en un laboratorio de medicina legal o forense para el análisis del perfil de ADN son las siguientes:
1. Extracción del ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre. 
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción
El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una enzima que corta el ADN dicatenario en donde tenga una seuencia característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'. 
3. Electroforesis en gel de agarosa
Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicaión de la muestra.
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")
Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot, conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel al secante, el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de la electroforesis. 
5. Hibridación con sonda radiactiva
Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el "calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones de temeratura y concentración de sales que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso de  sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.
6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía
Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como autorradiografía ( abreviado coloquialmente en inglés a "autorad"). 
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales
En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías de una misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN".

El Proyecto Biológico
University of Arizona
Tuesday, August 20, 1996
Traducido en Marzo 2004
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