Resolución de problemas

Cómo resolver los problemas encontrados durante la separación de DNA en geles de agarosa

Problema	Posible causa	Solución sugerida
No hay bandas o son muy débiles	La cantidad o la concentración de DNA en la muestra cargada al gel eran insuficientes.	Aumenta la cantidad de DNA. Una concentración baja puede también deberse al uso de pocillos muy anchos.
	Se había degradado el DNA.	Evita la contaminación con nucleasas.
	El DNA se ha salido por el extremo del gel durante la electroforesis.	Desarrolla la electroforesis durante menos tiempo, a menor voltaje o en un gel con mayor concentración de agarosa.
	Para DNA teñido con bromuro de etidio, se ha usado una lámpara de UV inadecuada.	Utiliza luz UV de longitud de onda corta (254 nm) para una detectabilidad óptima.
Faltan algunas bandas de DNA	Las moléculas pequeñas se han salido por el extremo del gel.	Desarrolla la electroforesis durante menos tiempo, a menor voltaje o en un gel con mayor concentración de agarosa. Asegúrate de que el tampón componente del gel es el mismo que el tampón de electroforesis (el usado para rellenar la cubeta).
	Las bandas de tamaño molecular similar no se han resuelto (es decir, no se han separado).	Aumenta el tiempo de electroforesis (puede requerir menor voltaje) y verifica que la concentración de agarosa en el gel es la adecuada para la resolución deseada.
	El DNA se ha desnaturalizado.	No calientes las muestras antes de la electroforesis.
Bandas borrosas, extendidas	El DNA se ha degradado.	Evita la contaminación con nucleasas.
	Se cargó demasiada cantidad de DNA.	Reduce la cantidad de muestra cargada en el gel.
	El DNA contenía demasiadas sales.	Elimina el exceso de sales en la muestra precipitando el DNA con etanol antes de la electroforesis.
	El DNA estaba contaminado con proteína.	Elimina las proteínas de la muestra extrayendo con fenol antes de la electroforesis.
	Las moléculas de DNA de pequeño tamaño difundieron durante la tinción.	Añade bromuro de etidio durante la electroforesis.
	El DNA se ha desnaturalizado.	No calientes las muestras antes de la electroforesis. Diluye el DNA en tampón con NaCl 20 mM.
	Para DNA superenrollado, se ha utilizado una cantidad insuficiente.	Verifica que las muestras contengan 2 mg/L de bromuro de etidio.
Migración anómala de las bandas	Se han epleado condiciones de electroforesis inapropiadas.	No permitas que el voltaje supere 20 V/cm. Mantén la temperatura por debajo de 30°C durante la electroforesis. Verifica que el tampón de electroforesis tenga suficiente capacidad tamponante.
Migración anómala de las bandas	El DNA se ha desnaturalizado.	No calientes las muestras antes de la electroforesis. Diluye el DNA en tampón con NaCl 20 mM.
Escasa diferencia en la intensidad de las bandas cuando se usan patrones de cuantificación en geles teñidos con bromuro de etidio.	Se ha cargado un volumen excesivo de muestra.	Cuanto menor sea el volumen de muestra, mayor será la diferencia en el grosor de las bandas para masas de DNA diferentes.
	El volumen de muestra cargado era mayor o menor que el de patrones.	Para una comparación exacta, carga volúmenes iguales de muestras y patrones.
	Se ha teñido con bromuro de etidio tras la electroforesis.	Para aumentar la diferencia en intensidad de las bandas, incluye el bromuro de etidio en el gel, en lugar de teñir tras acabar la electroforesis.
Bandas curvadas	La temperatura era desigual a lo largo del gel.	Refrigera todo el gel uniformemente, o nada en absoluto.
Bandas curvadas	La concentración de tampón era diferente en el gel y en el tampón de electroforesis.	Prepara el tampon de gel y el de electroforesis juntos en un mismo lote.