16.4 Método de Maxam y Gilbert
1. Marcaje
añadir polinucleótido quinasa del fago T4
Al ser el DNA bicatenario, resultan marcados los dos extremos. Deben separarse ambos, de lo contrario se secuenciarían ambas hebras a la vez y el resultado no sería interpretable.
Una forma de separar ambos extremos es por desnaturalización y aislamiento de cada hebra. Otra forma, común, es cortar el DNA y continuar con uno de los fragmentos, que ya sólo tiene un extremo marcado.
añadir una enzima de restricción que corte en un solo punto
Separación de ambos fragmentos (por electroforesis) y secuenciación por separado.
Si el DNA de partida fuese de hebra sencilla, habría bastado con marcarlo y no se precisa separación alguna.
2. Modificación de las bases y fragmentación controlada del DNA
Aunque el DNA sigue siendo bicatenario, sólo una hebra está marcada y es la única que se detectará. Por ello, a partir de aquí se representa sólo la hebra marcada, por simplicidad.
Usaremos como ejemplo la secuencia 5´ *pATCGATTCTCGGAGTCACACG 3´
La muestra de DNA se divide en 4 partes o alícuotas y cada una recibe un tratamiento químico diferente
Pulse en las flechas coloredas de la imagen siguiente para obtener más información.
Eliminación selectiva de bases:
Se han desarrollado 4 tratamientos para eliminar separadamente G, C, las bases purínicas (G y A), y las pirimidínicas (C y T). En todos los casos, se rompe el enlace N-glicosídico, dejando un sitio abásico (apurínico o apirimidínico) y manteniendo el esqueleto fosfato-desoxirribosa-fosfato.
Eliminación de guanina (en alícuota T1):
La guanina se metila con dimetilsulfato 1% y formiato amónico 50 mM. La metilguanina resultante se pierde al tratar con piperidina en medio básico.
Eliminación de guanina y adenina (en alícuota T2):
Se realiza una despurinación en medio ácido, concretamente fórmico al 80%.
Eliminación de citosina (en alícuota T3):
Con hidroxilamina 4 M a pH=6, o con hidrazina y alta concentración salina.
Eliminación de citosina y timina (en alícuota T4):
Con permanganato potásico 0,1 M, o con hidrazina sin sales.
Hidrólisis:
A continuación, en los 4 casos se consigue la ruptura de los enlaces fosfodiéster a ambos lados del sitio abásico, generando dos fragmentos polinucleotídicos (sólo uno de ellos marcado) y la desoxirribosa.
Veamos los resultados de los 4 tratamientos para la secuencia de ejemplo 5´ *pATCGATTCTCGGAGTCACACG 3´
Todas las moléculas presentes en un tubo se fragmentan por un mismo tipo de nucleótido, acorde a la reacción aplicada a ese tubo, pero cada una de las moléculas idénticas puede romperse aleatoriamente por cualquiera de las posiciones de dicho nucleótido. Si no se permite que la reacción sea exhaustiva, se obtendrá una mezcla de moléculas fragmentadas por los distintos puntos. La figura representa todas esas posibilidades (sólo para la hebra marcada, pues es la única que se detectará; r representa la desoxirribosa en el nucleótido abásico).
Pulse en las flechas coloredas para observar los resultados.
Como se describirá a continuación, el análisis de resultados (y la deducción de la secuencia) se basa en medir la longitud de los fragmentos de DNA marcados. Veamos (en la figura de aquí arriba) cuáles son esas longitudes (nº de nucleótidos de cada fragmento marcado).
3. Separación de los fragmentos y análisis
La mezcla resultante de cada una de las cuatro reacciones se separa por electroforesis en gel y se detecta por un método adecuado al marcaje introducido inicialmente (en el caso de fósforo radiactivo, mediante una autorradiografía del gel).
(no es preciso en el caso de muestra monocatenaria)
En un gel de poliacrilamida (entre 6 y 8%) se pueden observar las diferencias de longitud de un solo nucleótido. Si el gel incluye urea entre 6 y 8 M y se mantiene entre 40 y 50 °C (condiciones desnaturalizantes) se impide que los fragmentos formen puentes de hidrógeno entre sí, por lo que se mantienen como monocatenarios desplegados y se desplazan dependiendo exclusivamente de su longitud.
El revelado (para *p, mediante autorradiografía) muestra sólo los fragmentos marcados. (Los fragmentos de la hebra no marcada también se distribuyen a lo largo del gel, pero no se detectan.)
Interpretación de los resultados.
Análisis del patrón de bandas:
La posición de cada banda indica la longitud del fragmento marcado (gracias a la calibración del gel). Ésta coincide (véase subapartado 2 anterior) con la posición del nucleótido anterior a la base eliminada, puesto que el extremo 5´ es el marcado. Y la base eliminada viene determinada por la calle del gel (el tipo de tratamiento). En conclusión, los fragmentos, ordenados de menor a mayor (de abajo arriba), corresponden a la lectura de la secuencia, de 5´ a 3´.
Detalle del análisis:
Si la banda aparece en las calles “G” o “C”, la interpretación es obvia. Si lo hace en las calles “G+A” o “C+T”, hay que tener en cuenta si también aparece una banda en la “G” o “C”, respectivamente.