12.6 Detalles de la síntesis química de oligos

Detalles (reacciones, grupos protectores y activantes) de la síntesis de oligos por el método de Khorana

  1. 1. Activación del P 3´

    El grupo fosfato 3´ no se introduce como tal, sino en forma de otro grupo que, además de activar la reacción, al final se debe transformar en fosfato:
  2. 2. Protección del OH 5´

    Para la protección del grupo -OH 5´ se utiliza un grupo dimetoxitritilo (DMT), que se libera en medio ácido. Esta liberación se puede detectar colorimétricamente:
  3. 3. Protección de aminos

    Los grupos amino exocíclicos de las bases se protegen habitualmente con grupos benzoílo o isobutirilo que, una vez terminada la síntesis del oligo, se eliminan con amoniaco acuoso concentrado en caliente:
  4. 4. Resultado

    El resultado final es un nucleótido (dAMP en este ejemplo) preparado para participar en la síntesis:

    5’-O-dimetoxitritil-N6-benzoil-2’-desoxiadenosina-3’-O(metil-N,N-diisopropilamino)fosforamidita

Síntesis fotolitográfica

Las técnicas fotolitográficas, procedentes de la industria de semiconductores, consisten en el empleo de radiación luminosa para provocar una reacción química en una superficie convenientemente preparada. El diseño de "máscaras fotolitográficas" para que la luz sólo acceda a determinadas posiciones de un soporte permite llevar a cabo numerosas reacciones de síntesis de forma paralela.

La estrategia de la síntesis es análoga a la del método de Khorana, pero adaptada para permitir que el grupo protector del OH 5´ se pueda eliminar mediante irradiación con luz UV (en lugar del medio ácido empleado para liberar el DMT).

Cada posición o celdilla de la retícula en el biochip tiene típicamente entre 10 y 25 µm de lado, de modo que un chip (de 1 a 2 cm2) puede contener millones de secuencias diferentes.

En resumen, el método de síntesis transcurre así:

La animación avanza por etapas; para pasar a la siguiente, pulse sobre la imagen:

El ejemplo mostrado en la animación está, obviamente, muy simplificado: en el chip hay decenas o cientos de miles de celdillas (no 4) y los oligonucleótidos sintetizados tienen de 25 a 40 nucleótidos de longitud (no 3). No se detallan los reactivos ni las etapas de lavado necesarias.

Con esta técnica se consigue sintetizar, sobre la superficie del biochip, un gran número de oligonucleótidos, que permanecen anclados al soporte. Mediante la combinación de sucesivas máscaras, las moléculas de oligonucleótido que se forman en posiciones diferentes de la retícula poseen distinta secuencia. Ello permite después ensayar todas esas secuencias simultáneamente en un único experimento de hibridación.