12.4 Hibridación de Southern: procedimiento

  1. 1. Separación

    Se separan los fragmentos de DNA en un gel de electroforesis.

  2. 2. Desnaturalización

    Se trata el gel con una disolución alcalina
    mostrar el DNA

  3. 3. Transferencia

    Se prepara el "emparedado de transferencia"

    (de arriba a abajo)

    1

    peso para favorecer el flujo de líquido

    2

    bloque de papel absorbente

    3

    papel (“filtro”, “membrana”) de nitrocelulosa o nailon

    4

    gel con el DNA separado

    5

    esponja o bloque de papel absorbente

    6

    cubeta con tampón (de alta fuerza iónica)

    “Transferencia” (8-12 h): el tampón asciende por capilaridad y arrastra al DNA (en las “bandas”), que pasa desde el gel hacia la nitrocelulosa, en la cual se fija por adsorción.
    mostrar el DNA
    Opcionalmente, las moléculas de DNA se pueden fijar al soporte de modo más estable por entrecruzamiento químico inducido mediante irradiación ultravioleta.

  4. 4. Hibridación

    1. Se añade la sonda
    2. Se incuba para que tenga lugar la hibridación
    3. Se lava para eliminar el exceso de sonda no unida

  5. 5. Detección

    El resultado de la hibridación se revela con un método que depende del marcaje previo de la sonda: autorradiografía del filtro, detección de fluorescencia, análisis de imagen ...