regresar Ensayo ELISA para vitamina D

El nombre ELISA procede de Enyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ensayo de inmunosorción con enzima unida.

Vamos a utilizar placas de 96 pocillos (imagen a la derecha) cuyas paredes se recubren con el anticuerpo contra vitamina D. Cada pocillo tiene una capacidad de aproximadamente 300 µL.

El diseño de este ensayo en particular es competitivo (el antígeno y el antígeno marcado compiten para unirse al anticuerpo) y secuencial, pues no se mezclan con el anticuerpo de forma simultánea, sino que el antígeno marcado se unirá a los anticuerpos que no haya ocupado previamente el antígeno no marcado. Por ello, a mayor cantidad de antígeno en la muestra, menor será la señal detectada gracias a la actividad de la enzima ligada al segundo antígeno.

La reacción, catalizada por la peroxidasa, que permite la detección es:
TMB
El producto (tetrametilbencidina reducida) tiene un color azul que vira al amarillo cuando se añade el ácido fuerte que detiene la acción de la enzima.

A continuación simulamos el experimento (ve pulsando en los botones numerados):

anticuerpo contra la vitamina D
vitamina D en la muestra (o en disolución patrón)
vitamina D conjugada con peroxidasa
La representación es simbólica, y los tamaños no están a escala.

Una vez hayas construido la curva de calibrado, podemos pasar a la determinación de concentración de vitamina D en muestras problema (pulsa en la pestaña "Fase 2" más arriba).

Con cada valor de absorbancia que obtengas, usa la curva de calibrado para calcular la concentración en la muestra problema.

  Autoevaluación

Fase 1: calibrado Fase 2: muestras problema

Añadir anticuerpo, incubar para que se adsorba y lavar para retirar el exceso.

Preparar una muestra patrón con − + ng/mL de vitamina D.

Añadir la muestra e incubar 30 min a temperatura ambiente.

Vaciar para retirar el exceso y lavar 3 veces.

Añadir el antígeno marcado (vitamina D conjugada con peroxidasa) e incubar 30 min.

Vaciar para retirar el exceso y lavar 3 veces.

Añadir los sustratos para la peroxidasa: H2O2 + tetrametilbencidina (TMB).
Tras 20 min, detener la reacción añadiendo ácido.

Medir la absorbancia:0.000

A450
concentración de vit.D (ng/mL)
Muestras problema:

Imágenes de la placa multipocillo:
de Jeffrey M. Vinocur, con licencia Creative Commons CC-BY (atribución);
de J.N. Eskra, con licencia Creative Commons CC-BY-SA (atribución – compartir igual).