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Reactivos empleados en la electroforesis
de DNADNA y de proteínasproteínas

Agarosa :: Azul de bromofenol :: Azul de Coomassie :: Bromuro de etidio :: EDTA :: GelRed™ :: Glicerol :: β-mercaptoetanol :: Poliacrilamida :: SDS :: Tampón de carga :: Tampón TAE :: Tampón Tris-Gly :: Tampón Tris-HCl :: Tris :: Verde cianol :: Xileno-cianol

Componentes de disoluciones

TrisDNAproteínas

Es el nombre común de tris(hidroximetil) aminometano. Se trata de un compuesto muy utilizado en el laboratorio para preparar disoluciones tampón; el grupo ácido-base que ejerce el tamponamiento es el amino. Se comercializa en sus formas básica ("Tris base") y ácida ("Tris hidrocloruro"), aunque la primera es la de uso más común.

En la electroforesis, es el agente tamponante que mantiene el pH. Se incluye tanto en el gel como en el tampón de cubeta.

Véase: tampón Tris-HCl, tampón Tris-Gly, tampón TAE.

 

(HOCH2)3C-NH2
Mr 121 g/mol

EDTADNA

Acrónimo de EthyleneDiamine TetraAcetic acid, ácido etilendiamino tetraacético (a veces AEDT en español). En sus formas desprotonadas (2− y 4−), es un conocido agente quelante de cationes divalentes, en especial Ca2+ y Mg2+.

Dado que el Mg2+ es un cofactor requerido por la mayoría de nucleasas, su secuestro por el EDTA evita la degradación del DNA durante la preparación y la electroforesis.

fórmula del complejo EDTA con magnesio
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SDSproteínas

El dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate, SDS, laurilsulfato sódico) es un detergente aniónico que se une a las proteínas, desnaturalizándolas en una conformación extendida recubierta de moléculas de SDS. Como consecuencia, el tamaño de la molécula de proteína es directamente proporcional a su longitud en aminoácidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS que la recubre, que es también proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad electroforética de la proteína depende exclusivamente de su masa molecular.

En la electroforesis SDS-PAGE se usa (en el tampón de ruptpara desnaturalizar las proteínas de la muestra antes de aplicar ésta y como componente del gel para mantenerlas desplegadas durante la electroforesis.

 

H-(CH2)12-SO4

GlicerolDNAproteínas

El glicerol (glicerina) se utiliza como agente denso en la composición del tampón de carga.

La muestra + tampón de carga se deopsita al fondo del pocillo y no difunde por el tampón que llena la cubeta y cubre el gel. De ese modo no se pierde y se mantiene concentrada.

 HO-CH2
|   
HO-CH 
|   
HO-CH2

β-mercaptoetanolproteínas

Este compuesto (β-mercaptoetanol, 2-mercaptoetanol, 2-hidroxi-1-etanotiol, 2-sulfaniletan-1-ol) actúa como agente reductor de enlaces disulfuro. Facilita así la desnturalización completa y el desplegado de las moléculas de proteína. Además, se separarán las subunidades de la proteína si es que los disulfuro las mantenían unidas.

Al tratar las muestras con mercaptoetanol, el resultado de la electroforesis mostrará las subunidades componentes de las proteínas.

Tampón Tris-HClproteínas

Un tampón denominado "Tris-HCl" se prepara con Tris base a la concentración indicada y con el HCl necesario para ajustar el pH al valor indicado. La disolución, por tanto, contiene Tris base, Tris ácido y cloruro.

En la electroforesis, es el tampón que mantiene el pH en el gel.

Tampón Tris-Glyproteínas

Un tampón "Tris-glicina" se prepara con Tris base y con glicina, ambos a la concentración indicada. El pH debe resultar el adecuado sin necesidad de ajustarlo (pues este tampón no debe llevar cloruro). Una composición frecuente es 125 mM Gly, 25 mM Tris, pH=8,3. En el caso de electroforesis desnaturalizante lleva además 0,1% de SDS.

En la electroforesis PAGE discontinua, es el tampón con el que se llena la cubeta o tanque de electroforesis.

Tampón TAEDNA

Es el medio usado para preparar el gel y desarrollar la electroforesis. Recibe este nombre de las iniciales de sus componentes.
El pH es alcalino, para que todos los grupos fosfato del DNA estén ionizados por completo y éste se mantenga cargado negativamente. La composición habitual es Tris 40 mM, ác. acético 19 mM, EDTA 1 mM, pH=7,5

En la electroforesis, permite mantener las moléculas de DNA con una carga negativa uniforme y constante. Es, por ello, componente del gel y del tampón de electroforesis, o tampón de cubeta.

Tris
  +
Acético
  +
EDTA

Tampón de cargaDNAproteínas

Es una disolución que se mezcla con la muestra antes de aplicarla al gel. Sus componentes cumplen varios propósitos:

En electroforesis de DNA:

  • Glicerol para aportar densidad a la muestra y facilitar su aplicación a los pocillos.
  • Azul de bromofenol (u otro colorante como el xileno-cianol) como marcador del frente de avance de la electroforesis. Asimismo, su color es una ayuda visual durante la carga de muestra en los pocillos.
  • Tampón para estabilizar el pH.

En electroforesis de proteínas SDS-PAGE se denomina también tampón de ruptura (ya que provoca la desnaturalización):

  • Glicerol para aportar densidad a la muestra y facilitar su aplicación a los pocillos.
  • Azul de bromofenol como marcador del frente de avance de la electroforesis. Asimismo, su color es una ayuda visual durante la carga de muestra en los pocillos.
  • SDS para provocar la desnaturalización de las proteínas (ayudado por un calentamiento breve a 90-100° C).
  • β-mercaptoetanol para romper los enlaces disulfuro.
  • Tampón para estabilizar el pH.

Componentes del gel

Agarosa DNA

Se trata de un polisacárido sintetizado por algunas algas, que forma parte del agar-agar (ingrediente de medios de cultivo). Para su uso en electroforesis se emplea un producto más purificado. Tiene la propiedad de disolverse en caliente (50-60°C) y solidificar cuando se enfría, formando un gel de alta porosidad. Más detalles sobre su estructura.

En la electroforesis, forma la matriz del gel y provoca el retardo dependiente del tamaño que marca la separación.

PoliacrilamidaDNAproteínas

La poliacrilamida es un polímero entrecruzado que forma geles porosos. Se realiza una polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida [ N,N’-metileno-bis(acrilamida) ]. La acrilamida forma polímeros lineales pero la bisacrilamida introduce uniones cruzadas entre las cadenas de poliacrilamida, generando la malla, matriz o red tridimensional del gel. Regulando la concentración de ambos tipos de monómero y su proporción se consiguen distintas porosidades.

En la electroforesis, forma la matriz del gel y provoca el retardo dependiente del tamaño que marca la separación.

acrilamidabisacrilamida
poliacrilamida

Colorantes y fluorocromos

Azul de Coomassieproteínas

El nombre completo es azul brillante de Coomassie R-250. Se trata de un compuesto coloreado que se une a todo tipo de proteínas. Es poco soluble en agua, por lo que habitualmente se disuelve en una mezcla de agua, metanol o isopropanol y ácido acético.

Tras realizar la electroforesis, el gel se "tiñe" sumergiéndolo durante unos 30 minutos en la disolución de Coomassie para que éste penetre y se fije a las proteínas. Dado que todo el gel se impregna del colorante, es preciso después realizar una destinción, lavando varias veces con disolvente libre del colorante.

fórmula del azul de Coomassie
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Azul de bromofenolDNAproteínas

Se trata de un compuesto coloreado y con carga, utilizado para comprobar el progreso de la electroforesis. Más detalles.

En la electroforesis, por su menor tamaño, se mueve más rápido que las proteínas o que la mayoría de moléculas de DNA (siempre que éstas sean superiores a 300 pb), es decir, marca el "frente de avance". Puesto que su color azul-violeta es bien visible, permite detener la electroforesis con la confianza de que las moléculas de proteína o DNA no se hayan salido del gel.

fórmula del azul de bromofenol
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Xileno-cianol y verde cianolDNA

Se trata de compuestos coloreados y con carga, utilizados para comprobar el progreso de la electroforesis.

En la electroforesis el xileno-cianol se mueve aproximadamente como las moléculas de DNA de 3500 a 5000 pb (depende del tampón y el % de agarosa en el gel).

Ambos tienen un color azul turquesa que permite detener la electroforesis con la confianza de que las moléculas grandes de DNA no se hayan salido del gel.

fórmula del xileno-cianol
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fórmula del verde cianol
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Bromuro de etidioDNA

Se trata de un compuesto intercalante, es decir, que tiene afinidad para unirse al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se debe a su geometría plana y su estructura aromática, que interacciona favorablemente con el interior hidrófobo de la doble hélice. En menor medida, interacciona también con DNA monocatenario.

Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia, exaltada al encontrarse en un entorno hidrófobo, es decir, al estar unido al DNA. Se excita con luz ultravioleta de onda corta, 254 nm, y emite su fluorescencia como luz visible, de color rosado-anaranjado.

En la electroforesis, se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su posición en el gel. Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una disolución de bromuro de etidio, o bien incorporar éste a la disolución de agarosa con la que se prepara el gel.

fórmula del bromuro de etidio
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GelRed™DNA

Es la marca comercial de un compuesto adecuado para revelar el DNA en geles. Su estructura es un secreto comercial bajo patente, pero es algo similar al compuesto mostrado a la derecha.

  • Dos núcleos aromáticos: le confieren capacidad intercalante, es decir, que tiene afinidad para unirse al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se debe a su geometría plana y su estructura aromática, que interacciona favorablemente con el interior hidrófobo de la doble hélice.
  • Una cadena alifática larga que hace de conector entre ambos núcleos intercalantes.
  • Por otra pare, su ligera carga positiva también facilita su unión al DNA (recuérdese que éste es una molécula polianiónica).

Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia:

  • En forma libre, los dos núcleos aromáticos interaccionan entre sí y por ello la molécula apenas es fluorescente.
  • Al unirse al DNA los dos núcleos se separan y, al encontrarse en un entorno hidrófobo, emiten una fluorescencia intensa. Se excitan con luz ultravioleta de onda corta, 254 nm, y emiten luz visible, de color rojo (de ahí el nombre del reactivo).
transición al unirse al DNA

En la electroforesis, se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su posición en el gel. Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una disolución de GelRed™, o bien incorporar éste a la disolución de agarosa con la que se prepara el gel.

fórmula similar al GelRed
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