Actividades para usar la simulación Cromatografía en columna

Para obtener mejor provecho de estas actividades en el proceso de aprendizaje, se aconseja trabajarlas utilizando el simulador, en lugar de resolverlas como problemas teóricos escritos o mirar la respuesta inmediatamente.
Dado que se trata de actividades de resolución de problemas, y no de preguntas como en un libro de texto, deberás buscar fuera de esta sede web cualquier información que puedas necesitar acerca de las propiedades de las matrices cromatográficas o de las proteínas. Sin embargo, la mejor forma de aprender será la experimentación.

Actividad nº 1

Utilizando varias matrices de filtración en gel, determínese el orden relativo de elución de estas proteínas: aldolasa, aprotinina, conalbúmina, ferritina, glucosa-6P-deshidrogenasa.

Autoevaluación:
arrastra los nombres para reordenarlos dentro de la lista eluye antes
  • aldolasa
  • aprotinina
  • conalbúmina
  • ferritina
  • glucosa-6P-deshidrogenasa
eluye después

Cuando hayas terminado,
 

Actividad nº 2

a) ¿Cómo es la carga eléctrica de la ovalbúmina y la aldolasa en el tampón borato?

Autoevaluación:
selecciona la opción que elijas
carga negativa
sin carga
carga positiva

Cuando hayas terminado,
 

b) ¿Qué resina de intercambio iónico podría usarse para que ambas se retengan (>15 m) en la columna y se separen de la ribonucleasa A?

Autoevaluación:
selecciona la opción que elijas
CM-celulosa
DEAE-celulosa

Cuando hayas terminado,
 

Actividad nº 3

Observa la separación de una mezcla de tiroglobulina, glutatión reductasa y anhidrasa carbónica, empleando Sephacryl 100 y 300 (matrices de exclusión molecular o filtración en gel), y deduce: ¿Cuál de ellas tiene mayor tamaño molecular? ¿Es su masa molecular superior o inferior a 200 kDa?

Autoevaluación:
selecciona la opción que elijas
La proteína más grande es...
tiroglobulina
glutatión reductasa
anhidrasa carbónica

Cuando hayas terminado,
 

selecciona la opción que elijas
La masa molecular es...
>200 kDa
<200 kDa

Cuando hayas terminado,
 

Actividad nº 4

Encuentra una matriz cromatográfica que permita una buena separación de los 3 componentes de una mezcla de tiroglobulina, ribonucleasa A y ferritina.

Autoevaluación:
selecciona la opción que elijas

Cuando hayas terminado,
 

Actividad nº 5

a) ¿Qué proteína(s) se retienen en una columna rellena de IR-Sepharose 4B?

Autoevaluación:
arrastra a la columna izquierda las que queden retenidas, y a la derecha las que no
retenidas:
  • ovalbúmina
no retenidas:
  • ribonucleasa A
  • ferritina
  • His₆-luciferasa
  • glutamato deshidrogenasa

Cuando hayas terminado,
 

b) ¿Qué resina de intercambio iónico podrá usarse para retenerla(s) a pH=6.8?

Autoevaluación:
selecciona la opción que elijas
DEAE-celulosa
CM-celulosa

Cuando hayas terminado,
 

Actividad nº 6

a) ¿Qué proteínas se retienen en una columna rellena de Con A-Sepharose 4B? ¿Se retiene alguna de ellas más fuertemente que el resto?

Autoevaluación:
arrastra a la columna izquierda las que queden retenidas (y ordénalas), y a la derecha las que no
retenidas:
más retenida
  • ovalbúmina
menos retenida
no retenidas:
  • ribonucleasa A
  • tiroglobulina
  • conalbúmina
  • fosfogluconato deshidrogenasa

Cuando hayas terminado,
 

b) ¿Cuál es el motivo?

(respuesta abierta)

Actividad nº 7

¿Qué característica comparten las proteínas que se retienen en 2’5’ADP-Sepharose 4B?

(respuesta abierta)

Actividad nº 8

¿Qué proteína(s) se retienen en Ni2+-HiTrap Chelating HP?

Autoevaluación:
arrastra a la columna izquierda las que queden retenidas, y a la derecha las que no
retenidas:
  • conalbúmina
  • ferritina
no retenidas:
  • ribonucleasa A
  • tiroglobulina
  • His₆-luciferasa
  • glutatión deshidrogenasa

Cuando hayas terminado,
 

Actividad nº 9

Dada una mezcla de tres proteínas, A, B y C, con puntos isoeléctricos pI= 4.2, pIB = 7.0 y pI= 7.7, ¿podrían separarse empleando una sola cromatografía?

(respuesta abierta)

Actividad nº 10

La purificación de una proteína habitualmente requiere más de una cromatografía. Consideremos que estás trabajando en un laboratorio y necesitas purificar la DNA polimerasa a partir de un cultivo bacteriano. Dado que ya conoces la masa molecular de esa proteína, has realizado una cromatografía de exclusión a partir del lisado celular. Tras ello quieres aplicar una etapa de intercambio iónico. ¿Elegirías DEAE-celulosa o CM-celulosa como resina para esta cromatografía? Justifica la respuesta. Más adelante decides mejorar la purificación haciendo una cromatografía de afinidad. ¿Qué ligando inmovilizado utilizarías para retener la proteína de interés?

(respuesta abierta)