Espectrofotómetro UV-VIS virtual

Para conectar y desconectar el espectrofotómetro, pulsa el interruptor

Al pulsar en una de las botellas de reactivo se abrirá su tapón; a partir de ese momento la pipeta tomará de ese reactivo. Al pulsar de nuevo sobre la botella o su tapón, se cerrará.
Truco: mientras una botella esté abierta, basta con pasar el puntero por encima de la pipeta para que ésta se llene de nuevo.

Para añadir una alícuota de muestra a una cubeta:

  1. Selecciona una cubeta pulsando en ella o en la opciónbajo ella.
  2. Pulsa en la pipeta.

Para vaciar una cubeta, selecciónala y luego pulsa en el recipiente de desechos.

Para acceder al compartimento de la cubeta, pulsa el cierre o la propia tapa.

Para introducir una cubeta en el espectrofotómetro y para sacarla:

  1. Selecciona una cubeta pulsando en ella o en la opciónbajo ella.
  2. Pulsa en una de las flechas
  3. (Atención, es necesario que la tapa del compartimento esté abierta)

Acción de los botones e iconos:

  • registra la medida en la pantalla externa
  • registra un espectro
  • limpia borra toda la información mostrada en la pantalla
  • foto captura una imagen del espectro, que podrá copiarse o guardarse usando sobre ella el menú contextual del navegador
  • simboliza el recipiente de desechos; al pulsar sobre él, se vaciará la cubeta seleccionada

La pipeta dispensa alícuotas de 1 mℓ. Cada cubeta tiene una capacidad de 3 mℓ; si la superas, se derramará (después se vaciará la cubeta para poder continuar). Para poder medir en el espectrofotómetro, la cubeta debe contener al menos 2 mℓ de muestra.

La lectura de absorbancia indica ##### cuando no es posible medir: si la tapa del compartimento está abierta o si el volumen en la cubeta es insuficiente.

Relación entre absorbancia y concentración

estructura química del p-nitrofenol

Materiales: Utilizaremos una disolución de para-nitrofenol (pNF), que es un compuesto con color amarillo en medio alcalino.

Calibración: Primeramente, llena una cubeta con 3 mℓ de agua, introdúcela en el espectrofotómetro, ajusta la longitud de onda a 405 nm y pulsa el botón “A=0”. Saca la cubeta y vacíala.

Diseño del experimento: Utilizando el para-nitrofenol (pNF) y agua, prepara 3 muestras en sendas cubetas, que contengan distintos volúmenes de pNF y siempre un volumen total de 3 mℓ.

Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que hagas en tu cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en cada cubeta:

cubeta: 1 2 3  
volumen de pNF: mℓ
volumen de agua: mℓ

Una vez preparadas las 3 mezclas en las 3 cubetas, introdúcelas de una en una al espectrofotómetro y anota sus medidas de absorbancia.

cubeta: 1 2 3
A405 =

Análisis cualitativo de resultados: Observa la relación entre el color de las cubetas y el valor de absorbancia. Comparando las 3 medidas, ¿observas alguna dependencia entre el valor de absorbancia y la mayor o menor concentración de pNF en la cubeta?

Análisis cuantitativo de resultados: Calcula la concentración de pNF en la mezcla final de cada cubeta, sabiendo que la concentración en la botella es de 80 µM pNF. Prepara una tabla con los datos y traza una gráfica representando A frente a C. ¿Cómo puedes describir lo que observas?

cubeta C
(µM)
A405
A405
[pNF] (µM)
1
2
3

.

Fundamento de un ensayo de cuantificación de proteínas

El que se conoce como método de Bradford es un ensayo habitual para medir la concentración de proteínas en una muestra. Se basa en que la unión del colorante azul de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G250) a las proteínas modifica el espectro visible de aquél.

Materiales: Se dispone de

  • reactivo de Bradford, que contiene azul de Coomassie, metanol o isopropanol, y ácido fosfórico
  • proteínas disueltas en el reactivo

Diseño del experimento: Prepara una cubeta sólo con reactivo de Bradford y otras dos cubetas (o más) con cantidades diferentes de la disolución de proteína. Añade a todas las cubetas la cantidad de reactivo necesaria para un volumen total de 3 mℓ en cada una.

Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que hagas en tu cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en cada cubeta:

cubeta: 1 2 3  
volumen de proteína: mℓ
volumen de reactivo: mℓ

Calibración: Introduce la primera cubeta (que sólo contiene el reactivo de Bradford) en el espectrofotómetro, ajusta la longitud de onda a 595 nm y pulsa el botón “A=0”. Esta muestra se denomina el "tubo blanco" o "blanco de reactivos" y sirve para que el color propio del reactivo no se considere en la determinación de proteínas.

Medida: A continuación, introduce el resto de cubetas, de una en una, en el espectrofotómetro y anota sus medidas de absorbancia.

cubeta: 1 2 3
A595 =

Análisis cualitativo de resultados: Observa la relación entre el color de las cubetas y el valor de absorbancia. Comparando entre sí las medidas, ¿observas alguna dependencia entre la absorbancia y la mayor o menor concentración de proteínas en la cubeta?

Análisis cuantitativo de resultados: Calcula la concentración de proteínas en la mezcla final de cada cubeta, sabiendo que la concentración en la botella es de 800 mg/ℓ. Prepara una tabla con los datos y traza una gráfica representando A frente a C. ¿Cómo puedes describir lo que observas?

cubeta C
(mg/ℓ)
A595
A595
Cprot (mg/ℓ)
1
2
3

.

Espectro de absorción de la hemoglobina

El color rojo de la hemoglobina se debe a que absorbe radiación visible, aunque también presenta picos de absorción en y cerca de la región ultravioleta.

Diseño del experimento: Utilizando agua y la disolución de hemoglobina, prepara distintas diluciones y analiza su espectro UV-VIS completo. Para ello, llena una cubeta con hemoglobina y en las otras dos cubetas prepara sendas mezclas diferentes de hemoglobina con agua. Todas las cubetas deben tener un volumen total de 3 mℓ.

Para ayudarte a hacerlo, rellena previamente esta tabla (o mejor, una que hagas en tu cuaderno de laboratorio) con los volúmenes que piensas poner en cada cubeta:

cubeta: 1 2 3  
volumen de hemoglobina: mℓ
volumen de agua: mℓ

Medida: A continuación, introduce al espectrofotómetro las cubetas, de una en una, y pulsa el botón para registrar el espectro entre 200 y 800 nm. Pulsa en el icono de cámara de fotos y copia la imagen resultante para poderlas comparar todas al terminar el experimento.

Análisis cualitativo de resultados: Compara los 3 espectros. ¿Qué efecto se observa al diluir la hemoglobina de partida? ¿Cambia la posición (λ) de los picos de absorción máxima? Describe lo que observas.

2ª medida: Observando el espectro, anota dos longitudes de onda (de la región visible, no ultravioleta) en las que haya un pico (un máximo local de absorción). A continuación mide y anota la absorbancia de las 3 cubetas a cada una de esas dos longitudes de onda. Representa tus resultados en una gráfica, considerando que la concentración de partida de hemoglobina (en la botella) es de 200 mg/ℓ.

cubeta C
(mg/ℓ)
  λ1 =
A
λ2 =
A
A
CHb (mg/ℓ)
1  
2  
3  

Análisis cuantitativo de resultados: ¿Cómo puedes describir las conclusiones de lo observado? ¿Cuál de las longitudes de onda sería útil para determinar la concentración de muestras problema de hemoglobina?

suprimir la absorbancia de fondo
suprimir el error experimental de medida

.

.

Preparando el laboratorio...
UVISkan™ 100
espectro registro
#####
ajusta la longitud de onda ajusta a cero la absorbancia
desechos
A
λ (nm)
foto del espectro borra la pantalla Licencia Creative Commons BY NC SA