Espectrofotómetro UV-VIS virtual

Las micropipetas sirven para tomar líquido de las botellas de reactivos y transferirlo a los tubos de ensayo (preparando así las mezclas de reacción). La pipeta Pasteur sirve para tomar todo el líquido de los tubos y transferirlo a la cubeta de espectrofotómetro.

Qué son las micropipetas y cómo se usan (vídeo) en ventana nueva

Qué son las pipetas Pasteur y cómo se usan (vídeo) en ventana nueva

Uso de un espectrofotómetro y de las cubetas (con vídeos) en ventana nueva

Selecciona la micropipeta que quieres usar pulsando sobre ella (la que está seleccionada en cada momento tendrá iluminado en color naranja el indicador ; la otra lo tendrá en gris ). Si pulsas sobre la pipeta Pasteur, se desactivarán ambas micropipetas.

Las pipetas no deben arrastrarse, sino que debemos pulsar en el destino al que queremos que se desplacen (botella de reactivo, tubo de ensayo, cubeta o papelera de desechos sólidos).

Al pulsar en una de las botellas de reactivo se abrirá su tapón y la micropipeta que esté seleccionada se desplazará y tomará de ese reactivo.

Al pulsar sobre uno de los tubos de ensayo:

  • si está seleccionada una de las micropipetas y está cargada con muestra, se añadirá ésta al tubo;
  • si está seleccionada la pipeta Pasteur, aspirará el contenido del tubo.

Para añadir a la cubeta de espectrofotómetro una muestra contenida en la pipeta Pasteur, pulsa sobre la cubeta.

Procedimiento general:

  1. Ajusta el volumen de la micropipeta, pulsando en la mitad izquierda o la derecha de la rueda, o escribiendo en el dial.
  2. Selecciona la micropipeta pulsando en ella.
  3. Pulsa en una de las botellas para que la micropipeta se cargue en ella.
  4. Pulsa en uno de los tubos para que se vierta en él el contenido de la micropipeta.
  5. Prepara mezclas de varios reactivos, siguiendo ese procedimiento, en todos los tubos.
  6. Pulsa en la pipeta Pasteur para seleccionarla.
  7. Pulsa en un tubo para recoger su contenido con la pipeta Pasteur.
  8. Pulsa en la cubeta para verter en ella la muestra.

Para conectar y desconectar el espectrofotómetro, pulsa el interruptor

Para acceder al compartimento de la cubeta, pulsa el cierre o la propia tapa.

Para introducir una cubeta en el espectrofotómetro y para sacarla pulsa en una de las flechas

  1. (Atención, es necesario que la tapa del compartimento esté abierta)

Acción de los botones e iconos:

  • registra la medida en la pantalla externa
  • limpia borra toda la información mostrada en la pantalla
  • foto captura los datos mostrados en la pantalla, de modo que se puedan copiar para transferirlos a una hoja de cálculo o un documento
  • simboliza el recipiente de desechos líquidos; al pulsar sobre él, se vaciará la cubeta seleccionada
  • simboliza el recipiente de desechos sólidos; al pulsar sobre él, se descarta la punta de micropipeta o la pipeta Pasteur (tengan o no líquido)

Para vaciar la cubeta pulsa en el recipiente de desechos líquidos.

La pipeta Pasteur dispensa alícuotas de 2 mL. La cubeta tiene una capacidad de 3 mL; si la superas, se derramará (después se vaciará la cubeta para poder continuar). Para poder medir en el espectrofotómetro, la cubeta debe contener al menos 2 mL de muestra.

La lectura de absorbancia indica ##### cuando no es posible medir: si la tapa del compartimento está abierta o si el volumen en la cubeta es insuficiente.

Determinación de la concentración de glucosa por un método enzimático colorimétrico

Composición del tubo

Materiales:

  • Dos muestras en las que se quiere deteminar la concentración de glucosa
  • Disolución patrón de glucosa, 10 mg/dL
  • Disolución salina: NaCl 0.9 g/L
  • R: reactivo cromógeno, que contiene:
    • glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4)
    • peroxidasa (EC 1.11.1.7)
    • fenol
    • 4-aminofenazona (PubChem CID: 6009; InChIKey: RMMXTBMQSGEXHJ-UHFFFAOYSA-N)
    • tampón Tris 92 mM, pH=7.4

Preparación del experimento:

Conecta el espectrofotómetro y ajusta la longitud de onda a 505 nm.

Empleando las micropipetas de volumen variable P200 y P1000, prepara en los tubos de ensayo las mezclas descritas en la tabla: (puedes igualmente decidir otros volúmenes, pero el total en cada tubo debe ser de 1 mL)

tubo patrón
de glucosa 		muestra
problema		 disolución
salina
0 0   1000 µL
1 30 µL   970 µL
2 90 µL   910 µL
3 150 µL   850 µL
4 300 µL   700 µL
5 500 µL   500 µL
6   80 µL de muestra A 920 µL
7   40 µL de muestra A 960 µL
8   20 µL de muestra A 980 µL
9   200 µL de muestra B 800 µL
10   400 µL de muestra B 600 µL
11   700 µL de muestra B 300 µL

Cuando estén todos completos, añade 1 mL del reactivo cromógeno a cada uno de los tubos y para que se desarrolle la reacción (15 min virtuales).

Ejemplo de resultado en un experimento real.

Usa la pipeta Pasteur para transferir el contenido del tubo nº 0 a la cubeta de espectrofotómetro. Mete la cubeta al especrofotómetro y pulsa el botón “A=0”. Saca la cubeta y vacíala.

Transfiere con la pipeta Pasteur el contenido del tubo nº 1 a la cubeta, mete ésta al espectrofotómetro y anota el valor de absorbancia en tu cuaderno de laboratorio. Puedes pulsar el botón para registrar la lectura de absorbancia en la pantalla inferior.

Repite el procedimiento para el resto de tubos.

Construye una tabla con la concentración de glucosa en la mezcla de cada tubo (tubos 0 a 5) y el respectivo valor de absorbancia. Puedes pulsar el botón para copiar el listado de valores de absorbancia.

Análisis de resultados:

Anota en tu cuaderno de laboratorio el código asignado a tu experimento (en este caso es

Haz una gráfica representando las absorbancias obtenidas en cada tubo preparado con glucosa patrón (tubos 0 a 5) frente a la concentración de glucosa. Ajusta los datos a una línea recta.

A partir de esta recta, calcula:

  • la concentración de glucosa en cada uno de los tubos 6 a 11;
  • la concentración de glucosa en cada una de las dos muestras de partida (A y B).

Fundamento:

Reacción catalizada por la enzima, que permite la detección de su actividad:

Determinación de la glucemia (concentración de glucosa en sangre)

Composición del tubo

Materiales:

  • Dos muestras de suero en las que se quiere deteminar la concentración de glucosa
  • Disolución control de glucosa (o patrón), con concentración verificada de 100 mg/dL
  • Disolución salina: NaCl 0.9 g/L
  • R: reactivo cromógeno, que contiene:
    • glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4)
    • peroxidasa (EC 1.11.1.7)
    • fenol
    • 4-aminofenazona (PubChem CID: 6009; InChIKey: RMMXTBMQSGEXHJ-UHFFFAOYSA-N)
    • tampón Tris 92 mM, pH=7.4

Preparación del experimento:

Conecta el espectrofotómetro y ajusta la longitud de onda a 505 nm.

Notas importantes:

  • El control se va a analizar por triplicado (tubos 1, 2, 3).
  • Las diluciones del suero no se pueden realizar en este laboratorio virtual, pero se aplican internamente: aunque la pipeta tome muestra del frasco sin diluir, lo que se ponga en los tubos 7 y 10 se considerará diluido 1/2 y en los tubos 8 y 11 diluido 1/5.

Empleando las micropipetas de volumen variable P200 y P1000, prepara en los tubos de ensayo las mezclas descritas en la tabla:

tubo control
de glucosa 		muestra
problema		 disolución
salina
0 0   20 µL
1 20 µL    
2 20 µL    
3 20 µL    
       
6   20 µL de suero A  
7   20 µL de suero A diluido* 1/2 (lee la nota)
8   20 µL de suero A diluido* 1/5 (lee la nota)
9   20 µL de suero B  
10   20 µL de suero B diluido* 1/2 (lee la nota)
11   20 µL de suero B diluido* 1/5 (lee la nota)

Cuando estén todos completos, añade 2 mL del reactivo cromógeno a cada uno de los tubos y para que se desarrolle la reacción (15 min virtuales).

Usa la pipeta Pasteur para transferir el contenido del tubo nº 0 a la cubeta de espectrofotómetro. Mete la cubeta al especrofotómetro y pulsa el botón “A=0”. Saca la cubeta y vacíala.

Transfiere con la pipeta Pasteur el contenido del tubo nº 1 a la cubeta, mete ésta al espectrofotómetro y anota el valor de absorbancia en tu cuaderno de laboratorio. Puedes pulsar el botón para registrar la lectura de absorbancia en la pantalla inferior.

Repite el procedimiento para el resto de tubos.

Construye una tabla con las medidas. Puedes pulsar el botón para copiar el listado de valores de absorbancia.

Análisis de resultados:

Anota en tu cuaderno de laboratorio el código asignado a tu experimento (en este caso es

Calcula la concentración de glucosa en los tubos control (1 a 3) y calcula el promedio de sus absorbancias.

Empleando la ley de Lambert-Beer: A = ε × L × c, mediante comparación de cada muestra problema con el control, calcula:

  • la concentración de glucosa en cada uno de los tubos 6 a 11;
  • la concentración de glucosa en cada uno de los dos sueros de partida (A y B).

Fundamento:

Reacción catalizada por la enzima, que permite la detección de su actividad:

Determinación de la concentración de proteínas por un método colorimétrico: método de Lowry

Composición del tubo

F-C
A A
B1 B2

Materiales:

  • Dos muestras en las que se quiere deteminar la concentración de proteínas
  • Disolución patrón de seroalbúmina bovina, 2 g/L (BSA, bovine serum albumin)
  • Reactivo C: se prepara mezclando los reactivos A, B1 y B2 en proporciones 100 : 1 : 1 (volumen)
    • Reactivo A: Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1 M
    • Reactivo B1: CuSO4·5H2O al 1% (es decir, 1 g / 100 mL)
    • Reactivo B2: tartrato sódico-potásico al 2% (2 g / 100 mL)
  • Reactivo de Folin-Ciocalteau diluido 1/4 en agua (componente principal: ácido fosfomolibdotúngstico)

Preparación del experimento:

Conecta el espectrofotómetro y ajusta la longitud de onda a 580 nm.

Empleando las micropipetas de volumen variable P200 y P1000, prepara en los tubos de ensayo las mezclas descritas en la tabla: (puedes igualmente decidir otros volúmenes, pero el total en cada tubo debe ser de 400 µL)

tubo patrón
de albúmina 		muestra
problema		 agua
0 0   400 µL
1 30 µL   370 µL
2 60 µL   340 µL
3 90 µL   310 µL
4 120 µL   280 µL
5 150 µL   250 µL
6   120 µL de muestra A 280 µL
7   200 µL de muestra A 200 µL
8   120 µL de muestra B 280 µL
9   200 µL de muestra B 200 µL

Cuando estén todos completos, añade 2 mL del reactivo C a cada uno de los tubos y para que se desarrolle la primera reacción (10 min virtuales).

Añade 200 µL del reactivo de Folin a cada uno de los tubos y para que se desarrolle la segunda reacción (15 min virtuales).

Ejemplo de resultado en un experimento real.

Usa la pipeta Pasteur para transferir el contenido del tubo nº 0 a la cubeta de espectrofotómetro. Mete la cubeta al especrofotómetro y pulsa el botón “A=0”. Saca la cubeta y vacíala.

Transfiere con la pipeta Pasteur el contenido del tubo nº 1 a la cubeta, mete ésta al espectrofotómetro y anota el valor de absorbancia en tu cuaderno de laboratorio. Puedes pulsar el botón para registrar la lectura de absorbancia en la pantalla inferior.

Repite el procedimiento para el resto de tubos.

Construye una tabla con la concentración de proteínas en la mezcla de cada tubo (tubos 0 a 5) y el respectivo valor de absorbancia. Puedes pulsar el botón para copiar el listado de valores de absorbancia.

Análisis de resultados:

Anota en tu cuaderno de laboratorio el código asignado a tu experimento (en este caso es

Haz una gráfica representando las absorbancias obtenidas en cada tubo preparado con proteína patrón (tubos 0 a 5) frente a la concentración de proteína. Si el comportamiento es lineal, ajusta los datos a una línea recta; si se observa una curvatura (saturación de la reacción), obtendrás resultados más exactos ajustando a una polinómica de 2º grado o a una hipérbola rectangular.

A partir de esta recta, calcula:

  • la concentración de proteínas en cada uno de los tubos 6 a 11;
  • la concentración de proteínas en cada una de las dos muestras de partida (A y B).

Fundamento:

El medio alcalino provocn la desnaturalización de las proteínas y sus cadenas desplegadas se estabilizan gracias a que los átomos de N del esqueleto polipeptídico coordinan a los iones Cu2+. De esta forma quedan expuestos los residuos de tirosina y pueden reaccionar con el rectivo de Folin, que oxida los fenoles reduciéndose el molibdeno y tungsteno (wolframio) en un compuesto de color azul oscuro.

Determinación de la concentración de creatinina por un método colorimétrico

Composición del tubo

Materiales:

  • Dos muestras de orina en las que se quiere deteminar la concentración de creatinina
  • Disolución patrón de creatinina, 30 mg/L
  • Ácido pícrico saturado (PubChem CID: 6954; InChIKey: OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N)
  • NaOH 1 M

Preparación del experimento:

Conecta el espectrofotómetro y ajusta la longitud de onda a 520 nm.

Empleando las micropipetas de volumen variable P200 y P1000, prepara en los tubos de ensayo las mezclas descritas en la tabla: (puedes igualmente decidir otros volúmenes, pero el total en cada tubo debe ser de 1 mL)

tubo patrón
de creatinina 		muestra
problema		 agua
0 0   1.00 mL
1 0.25 mL   0.75 mL
2 0.50 mL   0.50 mL
3 0.75 mL   0.25 mL
4 1.00 mL   0
5      
6   20 µL de muestra A 980 µL
7   40 µL de muestra A 960 µL
8   80 µL de muestra A 920 µL
9   20 µL de muestra B 980 µL
10   40 µL de muestra B 960 µL
11   80 µL de muestra B 920 µL

Cuando estén todos completos, añade 0.75 mL de ácido pícrico y 0.25 mL de NaOH a cada uno de los tubos y para que se desarrolle la reacción (15 min virtuales).

Ejemplo de resultado en un experimento real.

Usa la pipeta Pasteur para transferir el contenido del tubo nº 0 a la cubeta de espectrofotómetro. Mete la cubeta al especrofotómetro y pulsa el botón “A=0”. Saca la cubeta y vacíala.

Transfiere con la pipeta Pasteur el contenido del tubo nº 1 a la cubeta, mete ésta al espectrofotómetro y anota el valor de absorbancia en tu cuaderno de laboratorio. Puedes pulsar el botón para registrar la lectura de absorbancia en la pantalla inferior.

Repite el procedimiento para el resto de tubos.

Construye una tabla con la concentración de creatinina en la mezcla de cada tubo (tubos 0 a 5) y el respectivo valor de absorbancia. Puedes pulsar el botón para copiar el listado de valores de absorbancia.

Análisis de resultados:

Anota en tu cuaderno de laboratorio el código asignado a tu experimento (en este caso es

Haz una gráfica representando las absorbancias obtenidas en cada tubo preparado con creatinina patrón (tubos 0 a 4) frente a la concentración de creatinina. Ajusta los datos a una línea recta.

A partir de esta recta, calcula:

  • la concentración de creatinina en cada uno de los tubos 6 a 11;
  • la concentración de creatinina en cada una de las dos muestras de partida (A y B);
  • el coeficiente de creatinina* de los individuos a los que corresponden las muestras.

Fundamento:

La reacción que permite la detección de la creatinina se basa el métdo original de Max Jaffe:

El producto, coloreado, pertenece a una familia de compuestos denominados complejos de Janovsky.

(*) Se define el coeficiente de creatinina como la cantidad de creatinina, en mg, excretada por día y por kg de peso del individuo.
  • M. Jaffe (1886) Zeitschrift für Physiologische Chemie 10: 391-400.
  • J.V. Janovsky, L. Erb (1886) doi:10.1002/cber.188601902113