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Ensayo de actividad enzimática

En este simulador o laboratorio virtual podemos explorar cómo la actividad de una enzima varía dependiendo de las condiciones del medio en el que se encuentra. La enzima que vamos a estudiar es la 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, EC 3.2.1.168, de Actinoplanes missouriensis, y está contenida en la muestra del ensayo.

El objetivo es encontrar las condiciones óptimas de pH y temperatura para esta enzima.

  1. Desplaza los controles para elegir un pH y una temperatura para el ensayo.
  2. Ve pulsando, en orden, los botones para añadir los componentes de la reacción a la cubeta del ensayo.
    El botón “añadir sustrato” vaciará antes la cubeta. El botón “añadir muestra” iniciará la incubación.
  3. Una vez se haya desarrollado el color, pulsa en el espectrofotómetro el botón para medir la absorbancia y anota su valor.
  4. Modifica de forma sistemática el pH o la temperatura y anota cada valor de absorbancia en tu cuaderno de trabajo o en la tabla de la derecha.
pH
7
T
50°C
tampón y
sustrato
muestra
incubar 1h
DNS
y 10 min a 100°C
540nm

Cuaderno de laboratorio:
(anota tus medidas)

Sugerencia: elabora sendas gráficas que muestren la variación de la absorbancia (que refleja la actividad enzimática) dependiendo, respectivamente, de la temperatura y del pH. Obtén a partir de ellas una estimación de la temperatura óptima y el pH óptimo para esta enzima.

Fundamento del ensayo (detalles de la reacción)

Ensayo de actividad enzimática de la ramnosil glucosidasa

La enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa (EC 3.2.1.168) hidroliza el enlace glucosídico de un sustrato que añadimos, la hesperidina, un glicósido natural formado por la unión de rutinosa con hesperetina. La rutinosa que se libera es el disacárido 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosa y tiene carácter reductor (en el C1 de la glucosa).

hesperidina   rutinosa   hesperetina
estructura de la hesperidina EC 3.2.1.168
flecha hacia la derecha
estructura de la rutinosa + estructura de la hesperetina

Se aplica entonces un ensayo para detectar azúcares reductores, consistente en su reacción con el dinitrosalicilato (DNS). El DNS, de color amarillo en medio básico, se reduce a 3-amino-5-nitrosalicilato, de color rojo ladrillo:

(el aldehído del azúcar reductor se oxida a ácido) Se mide el color rojo del producto a 540 nm.

reacción de oxidación del dinitrosalicilato aspecto de los tubos de ensayo

Basado en datos experimentales de Bárbara Neher; doi:10.​1007/​s00253-015-7088-x ; PMID:26549237

Versión 1.0, octubre 2018