Actividad no 2 con 
el ADN de la Familia Blackett

Métodos de análisis de STR

Supondremos que Ud. posee el conocimiento básico de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la electroforesis en gel, en particular en lo aplicable al análisis de secuencia de ADN. Nos centraremos en las características especiales de la PCR y de la electroforesis en gel que son relevantes para la caracterización de los STR. Si no está Ud. familiarizado con estas técnicas, aún debería ser capaz de completar esta Actividad.

Métodos para el análisis de los 13 loci STR del CODIS

1. Extracción del ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Para los ensayos de paternidad lo más habitual es usar células bucales del interior de la mejilla. Otras fuentes de ADN procedente de la escena de un delito pueden ser sangre, semen, tejido de una víctima mortal, células del folículo capilar o incluso saliva. El ADN extraído de las pruebas policiales se comparará con el ADN extraído de muestras de referencia, de individuos conocidos. 
2. Amplificación por PCR
Los cebadores de ADN se han optimizado para permitir la amplificación de múltiples loci STR en una sola mezcla de reacción. Ajustando cuidadosamente la distancia desde los cebadores hasta la secuencia tetramérica repetitiva, los productos de diferentes loci no se solaparán durante la electroforesis en gel.
Datos de muestra
En los resultados parciales que se muestran arriba, se están analizando al mismo tiempo los tres STR (D3S1358, vWA y FGA). Las longitudes de los ADN amplificados se muestran mediante la escala de 100 a 320 pb de la parte superior de la figura. El área central, con múltiples picos, corresponde a patrones de referencia que contienen los alelos conocidos para cada locus STR. Observe que los alelos de los tres loci diferentes no se solapan. El área inferior muestra los alelos de la madre de Bob Blackett, Nuria, para los loci D3S1358, vWA y FGA. Los alelos de Nuria se han comparado con los patrones de referencias mediante ordenador y están rotulados. La interpretación de este resultado indica que el genotipo de Nuria es (15,15) en el locus D3S1358, (14,16) en el vWA y (24,25) en el FGA.
3. Detección de los ADN tras la amplificación por PCR 
Los cebadores de PCR en los preparados comerciales (kits) empleados para el análisis de STR tienen moléculas fluorescentes unidas de forma covalente al cebador. Para ampliar el número de loci diferentes que se pueden analizar en una sola reacción de PCR, se usan múltiples conjuntos de cebadores con marcadores fluorescentes de diferente "color". Tras la reacción de PCR, se añaden a la mezcla de reacción patrones de longitud de ADN internos y se separan los ADN según su longitud en un aparato de electroforesis capilar. Los picos de ADN se van detectando según salen del gel, mediante activación por láser. Los aparatos de secunciación que se usan para separar los alelos y detectarlos son del mismo tipo que los que se usan actualmente en el Proyecto de Secuenciación del Genoma Humano, con una salida de datos digital que se puede analizar mediante programas de ordenador específicos.
Perfil de ejemplo
El producto comercial que utiliza Bob Blackett para la amplificación por PCR se denomina AmpFLSTR™ Profiler Plus PCR Amplification Kit, de la casa Applied Biosystems. En él se analizan nueve STR empleando tres conjuntos de cebadores, cada uno con un marcador fluorescente de distinto color. En la figura de arriba se representan los picos de fluorescencia azul obtenidos para 3 de los STR, fluorescencia verde para otros 3 y fluorescencia amarilla (mostrado en negro) para otros 3. Los picos en rojo son los patrones de tamaño de ADN. Mediante un programa de ordenador específico se muestran los diferentes colores en secciones separadas de datos y se determina la longitud exacta de los ADN. Un décimo marcador, denominado AMEL, se usa para diferenciar el ADN de los varones (X, Y) y de las mujeres (X, X).
En una segunda reacción de PCR se utiliza otro producto, llamado Cofiler Plus, para amplificar otros 4 loci STR adicionales y para repetir algunos de los loci analizados con Profiler. El resultado de las dos reacciones de PCR constituye, por tanto, el análisis del conjunto completo de los 13 STR del CODIS (incluyendo redundancia de algunos loci) y un ensayo de los cromosomas sexuales. Los resultados se obtienen en forma de alelos discretos, digitalizados, determinados a partir del tamaño exacto de los productos amplificados por comparación con los patrones.