Reactivos empleados en la electroforesis de DNA

Tampón TAE

Es el medio usado para preparar el gel y desarrollar la electroforesis. Recibe este nombre de las iniciales de sus componentes. El pH es alcalino, para que todos los grupos fosfato del DNA estén ionizados por completo y éste se mantenga cargado negativamente. La composición habitual es Tris 40 mM, ác. acético 19 mM, EDTA 1 mM, pH=7,5 En la electroforesis, permite mantener las moléculas de DNA con una carga negativa uniforme y constante. Es, por ello, componente del gel y del tampón de electroforesis, o tampón de cubeta.

Tris   + Acético   + EDTA

Tris

Es el nombre común de tris(hidroximetil) aminometano. Se trata de un compuesto muy utilizado en el laboratorio para preparar disoluciones tampón; el grupo ácido-base que ejerce el tamponamiento es el amino. Se comercializa en sus formas básica ("Tris base") y ácida ("Tris hidrocloruro"), aunque la primera es la de uso más común. Un tampón denominado "Tris-HCl" se prepara con Tris base a la concentración indicada y con el HCl necesario para ajustar el pH al valor indicado. En la electroforesis, es el agente tamponante que mantiene el pH.

(HOCH2)3C-NH2 Mr ≈ 121 g/mol

EDTA

Acrónimo de EthyleneDiamine TetraAcetic acid, ácido etilendiamino tetraacético (a veces AEDT en español). En sus formas desprotonadas (2− y 4−), es un conocido agente quelante de cationes divalentes, en especial Ca2+ y Mg2+. Dado que el Mg2+ es un cofactor requerido por la mayoría de nucleasas, su secuestro por el EDTA evita la degradación del DNA durante la preparación y la electroforesis.

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Azul de bromofenol

Se trata de un compuesto coloreado y con carga, utilizado para comprobar el progreso de la electroforesis. En la electroforesis, por su menor tamaño, se mueve más rápido que la mayoría de moléculas de DNA (siempre que éstas sean superiores a 300 pb), es decir, marca el "frente de avance". Puesto que su color azul-violeta es bien visible, permite detener la electroforesis con la confianza de que las moléculas de DNA no se hayan salido del gel.

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Xileno-cianol

Se trata de un compuesto coloreado y con carga, utilizado para comprobar el progreso de la electroforesis. En la electroforesis se mueve aproximadamente como las moléculas de DNA de 9000 pb. Puesto que su color azul es bien visible, permite detener la electroforesis con la confianza de que las moléculas grandes de DNA no se hayan salido del gel.

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Bromuro de etidio

Se trata de un compuesto intercalante, es decir, que tiene afinidad para unirse al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se debe a su geometría plana y su estructura aromática, que interacciona favorablemente con el interior hidrófobo de la doble hélice. En menor medida, interacciona también con DNA monocatenario. Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia, exaltada al encontrarse en un entorno hidrófobo, es decir, al estar unido al DNA. Se excita con luz ultravioleta de onda corta, 254 nm, y emite su fluorescencia como luz visible, de color rosado-anaranjado. En la electroforesis, se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su posición en el gel. Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una disolución de bromuro de etidio, o bien incorporar éste a la disolución de agarosa con la que se prepara el gel.

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GelRed™

Es la marca comercial de un compuesto adecuado para revelar el DNA en geles. Su estructura es un secreto comercial bajo patente, pero es algo similar al compuesto mostrado a la derecha. Dos núcleos aromáticos: le confieren capacidad intercalante, es decir, que tiene afinidad para unirse al DNA, pues se introduce entre sus bases apiladas. Esto se debe a su geometría plana y su estructura aromática, que interacciona favorablemente con el interior hidrófobo de la doble hélice. Una cadena alifática larga que hace de conector entre ambos núcleos intercalantes. Por otra pare, su ligera carga positiva también facilita su unión al DNA (recuérdese que éste es una molécula polianiónica). Su utilidad deriva asimismo de su fluorescencia: En forma libre, los dos núcleos aromáticos interaccionan entre sí y por ello la molécula apenas es fluorescente. Al unirse al DNA los dos núcleos se separan y, al encontrarse en un entorno hidrófobo, emiten una fluorescencia intensa. Se excitan con luz ultravioleta de onda corta, 254 nm, y emiten luz visible, de color rojo (de ahí el nombre del reactivo). En la electroforesis, se utiliza para "teñir" el DNA, para revelar su posición en el gel. Se puede bañar el gel tras la electroforesis en una disolución de GelRed™, o bien incorporar éste a la disolución de agarosa con la que se prepara el gel.

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